调节性T细胞的分化诱导

调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）是一类具有较低增殖能力，能够抑制免疫反应的细胞群，在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面发挥重要的作用。

Treg细胞在体内外具有调节功能，根据其表面标记、产生的细胞因子和作用机制的不同，Treg细胞可分为两类，一类是自然Treg细胞，即天然生成CD4＋Treg细胞，另一类为适应性Treg细胞，它包括Tr1细胞、Th3 细胞及CD8＋Treg细胞等多种亚型。

体内自然产生Treg约占外周血CD4＋T细胞的10％，在体外中研究发现，Treg细胞可以通过初始T细胞活化，同时受到抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、TGF-β和IL-10等共刺激信号的刺激诱导产生。

这样产生的Treg细胞称为iTreg，它能够表达Treg的表面标志CD25，也能表达Foxp3。

调节性T细胞的分化诱导的基本原理是Treg细胞可以通过初始T细胞活化，同时受到抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、TGF-β和IL-10等共刺激信号的刺激诱导产生。

调节性T细胞的分化诱导的基本过程可分为以下几步：

（1）包被：诱导分化的前一天，用终浓度为5 μg／ml抗CD3抗体包被96孔圆底细胞培养板，4 ℃过夜。

（2）初始细胞的制备：取C57BL／6J小鼠的脾脏并制成单细胞悬液，流式sorting 获得CD4＋CD25的初始CD4T细胞。

（3）用含10％ FBS的RPMI 1640调整细胞浓度为2x106个／ml，在96孔细胞培养板的每孔中加入50 μl的CD4＋CD25-T细胞（1x10个），每组设3个复孔。

（4）每孔加入终浓度为2 μg／ml的抗CD28抗体，每孔加入终浓度为1000 IU／ml（40 ng／ml）的IL-2和5 ng／ml的TGF-β。

（5）用含10％ FBS的RPMI 1640将每孔的总体积均补至200 μl，混匀后将96孔圆底细胞培养板置于37℃，5％ CO₂的细胞培养箱中培养4天。

（6）培养4天后收集化的Treg细胞，进行鉴定。

（7）Treg诱导分化的鉴定：

1）在蛋白质水平可以用流式细胞术检测CD25与Foxp3的表达情况以及阳性细胞的比例。