Th1和Th2细胞的分化诱导

初始CD4T细胞（即Th0细胞）在特异性抗原或特异性活化剂的作用下活化、分化为不同的Th细胞亚群，如Th1、Th2、Th17等。

Th1细胞通过分泌IL-2、IFN-y和TNF-β等细胞因子介导细胞免疫效应，在诱发以炎症反应为特征的器官特异性自身免疫病、器官移植排斥反应和抗感染免疫中发挥重要的作用。

Th2型细胞通过分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等细胞因子介导体液免疫，Th2型免疫反应失调可导致过敏和哮喘疾病的发生。

Th1和Th2细胞的分化诱导的基本原理是抗原特异性Th细胞反应常用以下两种模型。

一是以同种异型细胞作为抗原诱导同种异型T淋巴细胞反应；另一种则为可溶性抗原在同型的抗原提呈细胞提呈下，诱导TCR转基因小鼠来源CD4T淋巴细胞反应。

而非特异性Th细胞反应常采用包被的抗CD3和可溶性抗CD28抗体诱导；或者在抗原提呈细胞的辅助下，采用可溶性抗CD3抗体进行诱导。

为了获得不同细胞因子分泌特点与功能特征的Th细胞，一般可在诱导Th细胞反应时加入外源性细胞因子与联合应用细胞因子阻断性抗体以使Th0细胞向特定的方向分化。

简而言之，Th1的诱导需要加入IFN-Y、IL-12与抗IL-4，而Th2的诱导需要加入IL-4、抗IFN-y与抗IL-12。在相应的培养条件下诱导4天以上即可培养出相应的Th1或Th2细胞。

试剂：

1.C57BL／6J小鼠（雌性，6～8周龄，SPF级）

2. 抗CD3、抗CD28、抗IL-4、抗IL-12及抗IFN-Y抗体

3. rm IL-12、rm IL-4、含10％ FBS的RPMI 1640完全培养基

4. PMA

5. Ionomycin

6. Brefeldin A

仪器：

1. 96孔细胞培养板

2. 流式细胞仪

Th1和Th2细胞的分化诱导的基本过程可分为以下几步（以抗CD3和抗CD28抗体联合诱导非特异性CD4T细胞反应产生Th1和Th2为例进行介绍）：

（1）包被：诱导分化的前一天，用终浓度为5 μg／ml抗CD3抗体包被96孔细胞培养板，4 ℃过夜

（2）初始细胞的制备：取C57BL／6J小鼠的脾脏并制成单细胞悬液，采用磁珠分选CD4T细胞，获得CD4T细胞后用含10％FBS的RPMI 1640调整细胞浓度为2x106 个／ml，在96孔细胞培养板的每孔中加入50 μl的CD4T细胞（1x105个），每组设3个复孔

（3）每孔加入终浓度为2 μg／ml的抗CD28抗体

（4）诱导Th1时：加入终浓度为20 ng／ml的IL-12和终浓度为10 μg／ml的抗IL-4

（5）诱导Th2时：加入终浓度为40 ng／ml的IL-4、终浓度为10μg／ml的抗IFN-y和终浓度为10 μg／ml的抗IL-12

（6）用含10％ FBS的RPMI 1640将每孔的总体积均补至200 μl，混匀后将96孔圆底细胞培养板置于37 ℃、5％ CO₂的细胞培养箱中培养4天

（7）培养4天后收集分化的Th1和Th2细胞，鉴定相应的细胞因子分泌情况。可采用：

1）将分化的细胞采用诱导时相同的活化方式对细胞进行再刺激，活化24小时后收集上清，ELISA检测上清中Th1和Th2相关的细胞因子（Th1为IFN-y与IL-2，Th2为IL-4、IL-5与IL-13）。

本实验中各种细胞因子与阻断性抗起到决定性的作用，将会直接影响到Th细胞的分化方向与分化效率，因此应确保各种细胞因子与抗体的良好活性，可在-20 ℃或-80 ℃环境下保存，同时应避免反复冻融。