【进展】Th1/Th2细胞亚群的特异性表面标志及其鉴定
丁香园论坛
21019
:)Th1/Th2细胞亚群的特异性表面标志及其鉴定:D
刘金保 钟南山 李树浓
［主题词］ T淋巴细胞； 免疫，细胞
［中图分类号］ R331.1＋44 ［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-4718(2000)08-0757-04
Specific surface markers of Th1/Th2 subsets
and their identification
LIU Jin-bao, ZHONG Nan-shan, LI Shu-nong
(Department of Pathophysiology, Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182， China)
［A Review］ CD4+ T cells can be divided into Th1/Th2 subsets. Th1/Th2 imbalance participates many disease processes. A stable surface marker distinguishing Th1 and Th2 will greatly facilitate the investigation of Th1/Th2 interaction.Several surface molecules have been reported to be differentialy expressed between Th1 and Th2 cells.LAG-3,active ligands for P- and E-selectin ,IL-18R, IL-12Rβ2,CC chemokine receptor (CCR5) were shown to be dominantly expressed on Th1 cells,whereas expression of CD30,ST2L,CRTH2,CCR3,CCR4 was reported to be preferential to Th2 cells. In this review, several surface molecules were mainly discussed.
［MeSH］ T-lymphocytes; Immunity, cellular
1986年Mosmann等［1］根据T辅助淋巴细胞(CD4)分泌的细胞因子谱(cytokine profiles)的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β),介导细胞免疫应答；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促进抗体的产生，介导体液免疫反应。在多数免疫反应中，T辅助淋巴细胞并不产生典型的Th1或Th2细胞和因子，而主要是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下，Th0细胞受特异抗原的刺激时，一方面向Th1方向发展，另一方面可能向Th2方向发展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反应［2，3］,在I型超敏反应疾病时主要产生以Th2为主的免疫反应［4］。近几年来研究发现［5］，Th1/Th2平衡失调参与多种疾病过程，如肿瘤免疫、移植免疫及变态反应等。目前多数研究资料来源于抗原特异性的T细胞克隆和T细胞分泌的细胞因子的测定，对疾病状态下CD4+T细胞亚群的改变难以进行准确的判断。不少研究提出了Th1/Th2细胞的表面特异标志，但都未被学术界广泛接受，其中Th1细胞相关的表面分子主要包括：IL-18R、IL-12Rβ2、CC细胞因子受体(CC chemokine receptor，CCR5)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3）和选择素配体；Th2细胞相关表面分子主要包括：CD30、ST2L、趋化因子受体同源分子（chemoattractent receptor-homologous molecule，CRTH2）、CCR3和CCR4。本文主要介绍其中的几种表面分子以及Th1/Th2的鉴定。
一、Th1/Th2细胞的特异性表面标志
(一)CD30 CD30抗原属 TNF受体超家族成员，最早作为Reed-Sternberg细胞的特异标志物，也见于活化的T细胞和B细胞。CD30和CD30配基的相互作用提供T细胞增殖的共刺激信号。1995年 Prete等［6］根据自己的研究结论提出，Th2细胞可选择性地表达 CD30抗原，随后在不同疾病状态下的研究也得出了类似的结论。其主要依据是：(1)与 TH1/Th0细胞克隆相比， Th2细胞克隆 T淋巴细胞高表达 CD30；(2)诱导 Th2反应的抗原可明显上调 CD30的表达，而诱导 Th1细胞反应的抗原无此作用；(3)在体变应原诱导的变应性病人的 CD30+T细胞主要为变应原特异的 T淋巴细胞。但是很快又有报道不支持这一结论［7］。其实验依据为：(1)体外活化的CD45RO+CD30+T淋巴细胞可产生高水平的IFN-γ；(2)诱导Th1反应的结核菌素纯蛋白衍生物（purified protein derivative,PPD)，诱导 TH0细胞反应的破伤风毒素(tetanus-toxoid)及诱导Th2反应的抗原 (schistosomahaematobium、adult crom、toxocariacanis)均能诱导T淋巴细胞表达CD30，而且应用多色免疫荧光流式细胞技术获取的资料发现，CD30+细胞同样产生IFN-γ。从现有的研究资料来看， CD30并非Th2细胞的特异性标面标志物。
(二)IL-12Rβ2 Szabo等报道［8］，Th1细胞特异表达IL-12Rβ2亚单位，而Th2细胞几乎不表达。从DO11.10-TCR转基因小鼠分离的MEL-14hiCD4+T淋巴细胞，在抗原存在的条件下进行培养，其中加入IL-12、IL-4及加入IL-4、 IL-12抗体使其产生Th1或Th2细胞亚群，然后采用Northern blotting 分析IL-12R的表达情况，Th1亚群细胞均表达IL-12Rβ1及IL-12Rβ2 mRNA，但Th2细胞仅表达IL-12Rβ1而不表达IL-12Rβ2，Rogge也得出了类似的实验结果［9］。由于IL-12Rβ2报道较少，是否能作为 Th1细胞的特异标志尚有待进一步证实。
(三)ST2L 1998年，Xu等［10］报道， ST2L是 BALB/c小鼠Th2细胞的特异标志。通过差异显示PCR技术比较Th1和Th2克隆发现了一个Th2细胞特异基因，命名为ST2L基因，此基因编码的膜标面分子ST2L稳定表达在BALB/c小鼠Th2淋巴细胞而在Th1细胞表面不表达，即使多种免疫刺激剂刺激后仍稳定表达。用流式细胞技术分析发现，ST2L与细胞内IL-4共表达而不与IFN-γ共表达。体内研究也发现，抗ST2L抗体通过增加IFN-γ的产生和降低IL-4和IL-5的合成而促进Th1免疫反应；胶原诱导关节炎(collegen-induced artiritis，CIA)主要是Th1免疫反应介导的疾病，在体应用抗 ST2L抗体明显促进CIA的发生；利氏曼蠕虫感染主要以Th2免疫反应介导，在体应用抗 ST2L抗体可减轻疾病的损伤程度且回流区的淋巴结细胞产生大量的IFN-γ而产生少量的IL-4和 IL-5。经胶原致敏的DAB/1小鼠脾淋巴细胞体外应用抗ST2L抗体促进其增殖反应且产生大量的IFN-γ和 IL-6。在补体存在的条件下，抗ST2L抗体可溶解Th2细胞克隆对Th1细胞克隆无作用。ST2L抗体是否为Th2细胞特异标面标志尚需更多实验的证实。
(四)选择素介导的Th1细胞浸润［11］ P选择素和 E选择素是粘附分子选择素家族成员，介导细胞与细胞之间的粘附。Th1细胞低表达高亲和 E选择素配体和高表达 P选择素配体，但是Th2细胞均不表达这两种配体。在以Th1反应为主的动物实验模型中，Th1细胞选择性浸润炎症组织。在2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB)诱导的 DTH反应中，用不同标记物分别标记Th1和Th2细胞，然后给动物注射Th1和 Th2细胞，结果在炎症部位Th1细胞浸润数量超过Th2细胞的5倍。在抗原诱导的小鼠关节炎模型中，得出了类似的结论。但是在以Th2为主的变态反应哮喘动物模型中，抗原激发的肺组织内并没有Th1细胞的浸润增加。应用抗E和P选择素抗体明显阻断Th1细胞向炎性组织浸润。因此根据Th细胞表达 E和P选择素配体的异同一定程度上可以识别Th1和Th2细胞。 E选择素的配体尚未完全清楚，目前认为E选择素的配体是Sialyl Lewisx， P选择素的配体是PSGL-1。
(五)IL-18R 最近Xu［12］报道，IL-18R选择性地表达在小鼠的Th1细胞，而在Th2细胞不表达。实验发现，无论是长期培养的Th细胞克隆或是新形成的Th细胞克隆，Th1细胞稳定表达IL-18R，但是 ,Th2细胞始终不表达IL-18R，抗IL-18R抗体体内外均有抑制Th1细胞功能的作用。IL-18基因缺失小鼠表现为Th1细胞活性的丧失。
(六)LAG-3 最近Scala等［13］报道，淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activated gene-3，LAG-3）是Th1细胞的特异标志。LAG-3属免疫球蛋白超家族成员，LAG-3基因编码一个CD4样跨膜蛋白，可选择性地表达在Th1细胞。但是后来的实验研究证实，LAG-3不能作为Th1细胞的标面特异标志［14］。研究发现，尽管在CD4+T细胞克隆中，LAG-3只表达在产生IFN-γ的 T细胞，但是多数表达IL-4而不表达IFN-γ的CD8+细胞是 LAG-3+细胞；应用流式细胞技术分析多克隆 T细胞系的实验还发现，LAG-3可表达在IFN-γ阴性的CD4+和CD8+细胞，而且在此 T细胞系中多数细胞共表达LAG-3和CD30。
(七)CRTH2 Nagata等［15］报道了一个人类Th2细胞的表面特异分子CRTH2。在比较人类Th1和Th2基因时，作者克隆了一个新基因，此基因编码一个 G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor)，命名为CRTH2。CRTH2在新鲜分离的人类外周血CD4+细胞中表达率为0.4%～6.5%， B细胞及NK细胞几乎不表达，在应用PMA/ionomycin刺激CD4+细胞时，CRTH2+CD4+细胞产生Th2细胞因子几乎不产生 Th1细胞因子， CRTH2是否能作为Th2细胞的特异表面标志物有待进一步证实。
(八)其它标面标志物 近几年关于 CCR与 Th1/Th2关系的研究进展较快。CCR3［16］、CCR4［17］选择性表达在人类或小鼠的Th2细胞，CCR5［18］、CXCR4［19］选择表达在 Th1细胞。也有报道膜表面IFN-γ受体β链可选择性地表达在 Th1细胞［20］。
二、Th1/Th2细胞的鉴定
尽管目前提出了较多的 Th1/Th2细胞表面标志，但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手段，特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定方法。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将T淋巴细胞特异克隆。最近发现，在外周血白细胞中，除CD4淋巴细胞外，CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的变化［21］，甚至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力［22］，如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别Th1和Th2细胞。应用多标记技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性。类似于单细胞因子测定方法还有ELISPOT及单细胞PCR技术，此方法技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对Th1/Th2细胞的研究推向了一个新的阶段［23］。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍［23～25］。
(一)淋巴细胞刺激和细胞因子的阻止释放 自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。后来在T淋巴细胞培养过程中，加入高尔基抑制剂（golgistop，golgiplug）共培养，一方面不影响细胞因子的产生，另一方面使细胞因子在胞内聚集，增大信号/噪音（signal/noise）比。引入了高尔基抑制剂使在流式细胞仪上获得了较强的胞内细胞因子信号。文献曾对此获取的结果与ELISA测定的T细胞克隆产生的细胞因子进行了相关分析，两者有较好的相关性。常用的高尔基抑制剂有莫能霉素(monension)和Brefeldin A。在PMA/ionomycin活化T淋巴细胞时，外周血T淋巴细胞内IL-4、IL-5的检测在刺激后4～6 h可获得较强的信号，而细胞内IL-2和IFN-γ多在刺激后8～10 h。为了同时获得Th1/Th2胞内细胞因子信号，目前文献的报道多采用体外刺激4～6 h。
(二)细胞固定 细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。常用的固定剂为副福尔马林(paraformadehyde)，也有报道认为采用Parabenzoquinone(PBQ)作固定剂可减少背景荧光强度，获取较准确的信号。
(三)细胞穿透和标记 在应用荧光素标记的细胞因子单抗进行标记时，需要将标记的单抗引入到细胞内，即采用去污剂(detergent)使细胞膜穿透(permeabilization)。常用的细胞膜穿透剂有皂素(saponin)和n-octyl-B-D-glucopyranoside(OG)。在分析CD3+CD4+淋巴细胞因子时，最好在固定和穿透前，在活细胞上进行细胞表面抗原标记，以防止在固定和穿透过程中表面抗原的丢失，然后对细胞因子进行标记。根据CD4+细胞表达细胞因子的阳性细胞百分率来判断Th1和Th2细胞。
尽管胞内细胞因子标记流式细胞技术具有其它方法无可比拟的优越性，但是在操作过程中，需要对细胞进行刺激、阻断、固定、穿透和标记，任何一个环节都会影响实验的结果。国外已有用于流式细胞技术测定Th1/Th2的成套试剂盒供应，为Th1/Th2的研究提供了重要的手段。目前的研究迫切需要找到Th1/Th2细胞表面特异标志。
［基金项目］ 国家自然科学基金(No 39800059); 广东省自然科学基金(No 980460); 广东省医学科研课题(A1998233);广州市科委基础项目(98-J-003-01)
刘金保(广州医学院病理生理教研室， 广东 广州 510182)
钟南山(广州医学院病理生理教研室， 广东 广州 510182)
李树浓(广州医学院病理生理教研室， 广东 广州 510182)
［参 考 文 献］
［1］ Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, et al.Two types of murine helper T cell clone.I. Defination according to profiles of lymphokine activities and secreated proteins［J］. J Immunol, 1986, 136:2348～2357.
［2］ Sanchez FO, Rodriguez JI, Agudelo G, et al. Immune responsiveness and lymphokine production in patients with tuberculosis and healthy controls［J］. Infect Immun, 1994, 62(12):5673～5678.
［3］ Hernandez-Pando R, Orozcoe H, Sampirei A, et al. Correlation between the kinetics of Th1/Th2 cells and pathology in a murine model of experimental pulmonary tuberculosis［J］. Immunol, 1996,89:26～33.
［4］ Hamid Q, Azzawi M, Ying S, et al. Expression of mRNA for IL-5 in mucosal biopsies from asthma. J Clin Ivest, 1991,87:1541～1546.
［5］ Romagnani S. The Th1/Th2 paradigm［J］. Immunol Today, 1997, 18:263～266.
［6］ Del Prete G, De Carli M, Almerigogna F, et al. Preferential expression of CD30 by human CD4+T cells producing Th2 cytokines［J］. FASEB J, 1995, 9:81～86.
［7］ Hamann D, Hilkens CMU, Grogen JL, et al. CD30 expression does not discriminate between human Th1- and Th2-type T cells［J］. J Immunol, 1996, 156:1387～1391.
［8］ Szabo S, Gighe AS, Gubler U, et al. Regulation of the IL-12Rβ2 subunit expression in developing T helper 1(Th1) and Th2 cells［J］. J Exp Med, 1997, 185:817～824.
［9］ Rogge L, Barberis-Manino L, Biffi M, et al. Selective expression of an IL-12 receptor component by human T helper 1 cells［J］. J Exp Med, 1997, 185:825～831.
［10］ Xu D, Chan WL, Leung BP, et al. Selective expression of a stable cell surface molecule on type 2 but not type 1 helper T cells. J Exp Med, 1998, 187(5):787～794.
［11］ Austrup FD, Vestweber D, Borges E, et al. P-and E-selectin mediate recruitment of T-helper-1 but not T-helper-2 cells into inflammed tissues［J］. Nature, 1997, 385:81～83.
［12］ Xu D,Chan WL,Leung BP,et al.Selective expression and functions of IL-18 recptor on T helper(Th)type 1 but not Th2 cells［J］.J Exp Med,1998,188(8):1485～1492.
［13］ Annunziato FR,Manetti L,Tomasevic MG,et al.Expression and release of LAG-encoded protein by human CD4+ T cells are associated with IFN-γ production［J］. FASEB J,1996,10:767～776.
［14］ Scala E,Carbonari M,Del Porto P,et al.Lymphocyte activation gene -3(LAG-3)expression and IFN-γ production are variably coregulated in different human T lymphocyte subpopulations［J］.J Immunol,1998,161:489～493.
［15］ Nagata K,Tanaka K,Ogawa K,et al.Selective expression of a novel surface molecules by human Th2 cells in vivo［J］.J Immunol,1999,162:1278～1286.
［16］ Sallusto F, Mackay CR, Lanzavecchia A. Selective expression of the eotaxin receptor CCR3 by human T helper 2 cells［J］. Science, 1997, 277:2005～2007.
［17］ Bonecchi RG,Bianchi PP,Bordignon D, et al.Differential expression of chemokine receptors and chemokine responsiveness of type 1 T helper cells (Th1s) and Th2s［J］.J Exp Med,1998,187:129～135.
［18］ Loetscher PM,Uguccioni L,Bordoli M,et al. CCR5 is characteristic of Th1 lymphocytes［J］. Nature,1998,391:344～347.
［19］ Jourdan P,Abbal C,Nora N,et al.Cutting edge:IL-4 induces functional cell-surface expression of CXCR4 on human T cells［J］. J Immunol,1998,160:4153～4158.
［20］ Pernis AS, Gupta KJ, Gollob E , et al. Lack of interferonγ receptor β chain and the prevention of interferon γ signalling in Th1 cells［J］. Science,1995,269:245～247.
［21］ Manetti R, Annunziato F, Biagotti R, et al. CD30 expression by CD8+ T cells producing type 2 helper cytokines. Evidence for large numbers of CD8+CD30+ clones in human immunodeficiency virus infection［J］. J Exp Med, 1994, 180:2407～2411.
［22］ Weller PF, Lim K, Wan H-C, et al. Role of the eosinophil in allergic reactions［J］. Eur Respir J, 1996, 9:suppl.22, 109s～115s.
［23］ Prussin C. Cytokine flow cytometry:understanding cytokine biology at the singel-cell level［J］. J Clin Immunol, 1997, 17:195～204.
［24］ Thomas J, Schauer U, Heusser C, et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry［J］. J Immunol Methods, 1993, 159:197～207.
［25］ Jacob MC, Favre M, Bensa JC. Membrane cell permeabilization with saponin and multiparametric analysis by flow cytometry［J］. Cytometry, 1991, 12:550～557.
刘金保 钟南山 李树浓
［主题词］ T淋巴细胞； 免疫，细胞
［中图分类号］ R331.1＋44 ［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-4718(2000)08-0757-04
Specific surface markers of Th1/Th2 subsets
and their identification
LIU Jin-bao, ZHONG Nan-shan, LI Shu-nong
(Department of Pathophysiology, Guangzhou Medical College,Guangzhou 510182， China)
［A Review］ CD4+ T cells can be divided into Th1/Th2 subsets. Th1/Th2 imbalance participates many disease processes. A stable surface marker distinguishing Th1 and Th2 will greatly facilitate the investigation of Th1/Th2 interaction.Several surface molecules have been reported to be differentialy expressed between Th1 and Th2 cells.LAG-3,active ligands for P- and E-selectin ,IL-18R, IL-12Rβ2,CC chemokine receptor (CCR5) were shown to be dominantly expressed on Th1 cells,whereas expression of CD30,ST2L,CRTH2,CCR3,CCR4 was reported to be preferential to Th2 cells. In this review, several surface molecules were mainly discussed.
［MeSH］ T-lymphocytes; Immunity, cellular
1986年Mosmann等［1］根据T辅助淋巴细胞(CD4)分泌的细胞因子谱(cytokine profiles)的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β),介导细胞免疫应答；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促进抗体的产生，介导体液免疫反应。在多数免疫反应中，T辅助淋巴细胞并不产生典型的Th1或Th2细胞和因子，而主要是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下，Th0细胞受特异抗原的刺激时，一方面向Th1方向发展，另一方面可能向Th2方向发展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反应［2，3］,在I型超敏反应疾病时主要产生以Th2为主的免疫反应［4］。近几年来研究发现［5］，Th1/Th2平衡失调参与多种疾病过程，如肿瘤免疫、移植免疫及变态反应等。目前多数研究资料来源于抗原特异性的T细胞克隆和T细胞分泌的细胞因子的测定，对疾病状态下CD4+T细胞亚群的改变难以进行准确的判断。不少研究提出了Th1/Th2细胞的表面特异标志，但都未被学术界广泛接受，其中Th1细胞相关的表面分子主要包括：IL-18R、IL-12Rβ2、CC细胞因子受体(CC chemokine receptor，CCR5)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3）和选择素配体；Th2细胞相关表面分子主要包括：CD30、ST2L、趋化因子受体同源分子（chemoattractent receptor-homologous molecule，CRTH2）、CCR3和CCR4。本文主要介绍其中的几种表面分子以及Th1/Th2的鉴定。
一、Th1/Th2细胞的特异性表面标志
(一)CD30 CD30抗原属 TNF受体超家族成员，最早作为Reed-Sternberg细胞的特异标志物，也见于活化的T细胞和B细胞。CD30和CD30配基的相互作用提供T细胞增殖的共刺激信号。1995年 Prete等［6］根据自己的研究结论提出，Th2细胞可选择性地表达 CD30抗原，随后在不同疾病状态下的研究也得出了类似的结论。其主要依据是：(1)与 TH1/Th0细胞克隆相比， Th2细胞克隆 T淋巴细胞高表达 CD30；(2)诱导 Th2反应的抗原可明显上调 CD30的表达，而诱导 Th1细胞反应的抗原无此作用；(3)在体变应原诱导的变应性病人的 CD30+T细胞主要为变应原特异的 T淋巴细胞。但是很快又有报道不支持这一结论［7］。其实验依据为：(1)体外活化的CD45RO+CD30+T淋巴细胞可产生高水平的IFN-γ；(2)诱导Th1反应的结核菌素纯蛋白衍生物（purified protein derivative,PPD)，诱导 TH0细胞反应的破伤风毒素(tetanus-toxoid)及诱导Th2反应的抗原 (schistosomahaematobium、adult crom、toxocariacanis)均能诱导T淋巴细胞表达CD30，而且应用多色免疫荧光流式细胞技术获取的资料发现，CD30+细胞同样产生IFN-γ。从现有的研究资料来看， CD30并非Th2细胞的特异性标面标志物。
(二)IL-12Rβ2 Szabo等报道［8］，Th1细胞特异表达IL-12Rβ2亚单位，而Th2细胞几乎不表达。从DO11.10-TCR转基因小鼠分离的MEL-14hiCD4+T淋巴细胞，在抗原存在的条件下进行培养，其中加入IL-12、IL-4及加入IL-4、 IL-12抗体使其产生Th1或Th2细胞亚群，然后采用Northern blotting 分析IL-12R的表达情况，Th1亚群细胞均表达IL-12Rβ1及IL-12Rβ2 mRNA，但Th2细胞仅表达IL-12Rβ1而不表达IL-12Rβ2，Rogge也得出了类似的实验结果［9］。由于IL-12Rβ2报道较少，是否能作为 Th1细胞的特异标志尚有待进一步证实。
(三)ST2L 1998年，Xu等［10］报道， ST2L是 BALB/c小鼠Th2细胞的特异标志。通过差异显示PCR技术比较Th1和Th2克隆发现了一个Th2细胞特异基因，命名为ST2L基因，此基因编码的膜标面分子ST2L稳定表达在BALB/c小鼠Th2淋巴细胞而在Th1细胞表面不表达，即使多种免疫刺激剂刺激后仍稳定表达。用流式细胞技术分析发现，ST2L与细胞内IL-4共表达而不与IFN-γ共表达。体内研究也发现，抗ST2L抗体通过增加IFN-γ的产生和降低IL-4和IL-5的合成而促进Th1免疫反应；胶原诱导关节炎(collegen-induced artiritis，CIA)主要是Th1免疫反应介导的疾病，在体应用抗 ST2L抗体明显促进CIA的发生；利氏曼蠕虫感染主要以Th2免疫反应介导，在体应用抗 ST2L抗体可减轻疾病的损伤程度且回流区的淋巴结细胞产生大量的IFN-γ而产生少量的IL-4和 IL-5。经胶原致敏的DAB/1小鼠脾淋巴细胞体外应用抗ST2L抗体促进其增殖反应且产生大量的IFN-γ和 IL-6。在补体存在的条件下，抗ST2L抗体可溶解Th2细胞克隆对Th1细胞克隆无作用。ST2L抗体是否为Th2细胞特异标面标志尚需更多实验的证实。
(四)选择素介导的Th1细胞浸润［11］ P选择素和 E选择素是粘附分子选择素家族成员，介导细胞与细胞之间的粘附。Th1细胞低表达高亲和 E选择素配体和高表达 P选择素配体，但是Th2细胞均不表达这两种配体。在以Th1反应为主的动物实验模型中，Th1细胞选择性浸润炎症组织。在2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB)诱导的 DTH反应中，用不同标记物分别标记Th1和Th2细胞，然后给动物注射Th1和 Th2细胞，结果在炎症部位Th1细胞浸润数量超过Th2细胞的5倍。在抗原诱导的小鼠关节炎模型中，得出了类似的结论。但是在以Th2为主的变态反应哮喘动物模型中，抗原激发的肺组织内并没有Th1细胞的浸润增加。应用抗E和P选择素抗体明显阻断Th1细胞向炎性组织浸润。因此根据Th细胞表达 E和P选择素配体的异同一定程度上可以识别Th1和Th2细胞。 E选择素的配体尚未完全清楚，目前认为E选择素的配体是Sialyl Lewisx， P选择素的配体是PSGL-1。
(五)IL-18R 最近Xu［12］报道，IL-18R选择性地表达在小鼠的Th1细胞，而在Th2细胞不表达。实验发现，无论是长期培养的Th细胞克隆或是新形成的Th细胞克隆，Th1细胞稳定表达IL-18R，但是 ,Th2细胞始终不表达IL-18R，抗IL-18R抗体体内外均有抑制Th1细胞功能的作用。IL-18基因缺失小鼠表现为Th1细胞活性的丧失。
(六)LAG-3 最近Scala等［13］报道，淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activated gene-3，LAG-3）是Th1细胞的特异标志。LAG-3属免疫球蛋白超家族成员，LAG-3基因编码一个CD4样跨膜蛋白，可选择性地表达在Th1细胞。但是后来的实验研究证实，LAG-3不能作为Th1细胞的标面特异标志［14］。研究发现，尽管在CD4+T细胞克隆中，LAG-3只表达在产生IFN-γ的 T细胞，但是多数表达IL-4而不表达IFN-γ的CD8+细胞是 LAG-3+细胞；应用流式细胞技术分析多克隆 T细胞系的实验还发现，LAG-3可表达在IFN-γ阴性的CD4+和CD8+细胞，而且在此 T细胞系中多数细胞共表达LAG-3和CD30。
(七)CRTH2 Nagata等［15］报道了一个人类Th2细胞的表面特异分子CRTH2。在比较人类Th1和Th2基因时，作者克隆了一个新基因，此基因编码一个 G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor)，命名为CRTH2。CRTH2在新鲜分离的人类外周血CD4+细胞中表达率为0.4%～6.5%， B细胞及NK细胞几乎不表达，在应用PMA/ionomycin刺激CD4+细胞时，CRTH2+CD4+细胞产生Th2细胞因子几乎不产生 Th1细胞因子， CRTH2是否能作为Th2细胞的特异表面标志物有待进一步证实。
(八)其它标面标志物 近几年关于 CCR与 Th1/Th2关系的研究进展较快。CCR3［16］、CCR4［17］选择性表达在人类或小鼠的Th2细胞，CCR5［18］、CXCR4［19］选择表达在 Th1细胞。也有报道膜表面IFN-γ受体β链可选择性地表达在 Th1细胞［20］。
二、Th1/Th2细胞的鉴定
尽管目前提出了较多的 Th1/Th2细胞表面标志，但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手段，特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定方法。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将T淋巴细胞特异克隆。最近发现，在外周血白细胞中，除CD4淋巴细胞外，CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的变化［21］，甚至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力［22］，如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别Th1和Th2细胞。应用多标记技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性。类似于单细胞因子测定方法还有ELISPOT及单细胞PCR技术，此方法技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对Th1/Th2细胞的研究推向了一个新的阶段［23］。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍［23～25］。
(一)淋巴细胞刺激和细胞因子的阻止释放 自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。后来在T淋巴细胞培养过程中，加入高尔基抑制剂（golgistop，golgiplug）共培养，一方面不影响细胞因子的产生，另一方面使细胞因子在胞内聚集，增大信号/噪音（signal/noise）比。引入了高尔基抑制剂使在流式细胞仪上获得了较强的胞内细胞因子信号。文献曾对此获取的结果与ELISA测定的T细胞克隆产生的细胞因子进行了相关分析，两者有较好的相关性。常用的高尔基抑制剂有莫能霉素(monension)和Brefeldin A。在PMA/ionomycin活化T淋巴细胞时，外周血T淋巴细胞内IL-4、IL-5的检测在刺激后4～6 h可获得较强的信号，而细胞内IL-2和IFN-γ多在刺激后8～10 h。为了同时获得Th1/Th2胞内细胞因子信号，目前文献的报道多采用体外刺激4～6 h。
(二)细胞固定 细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。常用的固定剂为副福尔马林(paraformadehyde)，也有报道认为采用Parabenzoquinone(PBQ)作固定剂可减少背景荧光强度，获取较准确的信号。
(三)细胞穿透和标记 在应用荧光素标记的细胞因子单抗进行标记时，需要将标记的单抗引入到细胞内，即采用去污剂(detergent)使细胞膜穿透(permeabilization)。常用的细胞膜穿透剂有皂素(saponin)和n-octyl-B-D-glucopyranoside(OG)。在分析CD3+CD4+淋巴细胞因子时，最好在固定和穿透前，在活细胞上进行细胞表面抗原标记，以防止在固定和穿透过程中表面抗原的丢失，然后对细胞因子进行标记。根据CD4+细胞表达细胞因子的阳性细胞百分率来判断Th1和Th2细胞。
尽管胞内细胞因子标记流式细胞技术具有其它方法无可比拟的优越性，但是在操作过程中，需要对细胞进行刺激、阻断、固定、穿透和标记，任何一个环节都会影响实验的结果。国外已有用于流式细胞技术测定Th1/Th2的成套试剂盒供应，为Th1/Th2的研究提供了重要的手段。目前的研究迫切需要找到Th1/Th2细胞表面特异标志。
［基金项目］ 国家自然科学基金(No 39800059); 广东省自然科学基金(No 980460); 广东省医学科研课题(A1998233);广州市科委基础项目(98-J-003-01)
刘金保(广州医学院病理生理教研室， 广东 广州 510182)
钟南山(广州医学院病理生理教研室， 广东 广州 510182)
李树浓(广州医学院病理生理教研室， 广东 广州 510182)
［参 考 文 献］
［1］ Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, et al.Two types of murine helper T cell clone.I. Defination according to profiles of lymphokine activities and secreated proteins［J］. J Immunol, 1986, 136:2348～2357.
［2］ Sanchez FO, Rodriguez JI, Agudelo G, et al. Immune responsiveness and lymphokine production in patients with tuberculosis and healthy controls［J］. Infect Immun, 1994, 62(12):5673～5678.
［3］ Hernandez-Pando R, Orozcoe H, Sampirei A, et al. Correlation between the kinetics of Th1/Th2 cells and pathology in a murine model of experimental pulmonary tuberculosis［J］. Immunol, 1996,89:26～33.
［4］ Hamid Q, Azzawi M, Ying S, et al. Expression of mRNA for IL-5 in mucosal biopsies from asthma. J Clin Ivest, 1991,87:1541～1546.
［5］ Romagnani S. The Th1/Th2 paradigm［J］. Immunol Today, 1997, 18:263～266.
［6］ Del Prete G, De Carli M, Almerigogna F, et al. Preferential expression of CD30 by human CD4+T cells producing Th2 cytokines［J］. FASEB J, 1995, 9:81～86.
［7］ Hamann D, Hilkens CMU, Grogen JL, et al. CD30 expression does not discriminate between human Th1- and Th2-type T cells［J］. J Immunol, 1996, 156:1387～1391.
［8］ Szabo S, Gighe AS, Gubler U, et al. Regulation of the IL-12Rβ2 subunit expression in developing T helper 1(Th1) and Th2 cells［J］. J Exp Med, 1997, 185:817～824.
［9］ Rogge L, Barberis-Manino L, Biffi M, et al. Selective expression of an IL-12 receptor component by human T helper 1 cells［J］. J Exp Med, 1997, 185:825～831.
［10］ Xu D, Chan WL, Leung BP, et al. Selective expression of a stable cell surface molecule on type 2 but not type 1 helper T cells. J Exp Med, 1998, 187(5):787～794.
［11］ Austrup FD, Vestweber D, Borges E, et al. P-and E-selectin mediate recruitment of T-helper-1 but not T-helper-2 cells into inflammed tissues［J］. Nature, 1997, 385:81～83.
［12］ Xu D,Chan WL,Leung BP,et al.Selective expression and functions of IL-18 recptor on T helper(Th)type 1 but not Th2 cells［J］.J Exp Med,1998,188(8):1485～1492.
［13］ Annunziato FR,Manetti L,Tomasevic MG,et al.Expression and release of LAG-encoded protein by human CD4+ T cells are associated with IFN-γ production［J］. FASEB J,1996,10:767～776.
［14］ Scala E,Carbonari M,Del Porto P,et al.Lymphocyte activation gene -3(LAG-3)expression and IFN-γ production are variably coregulated in different human T lymphocyte subpopulations［J］.J Immunol,1998,161:489～493.
［15］ Nagata K,Tanaka K,Ogawa K,et al.Selective expression of a novel surface molecules by human Th2 cells in vivo［J］.J Immunol,1999,162:1278～1286.
［16］ Sallusto F, Mackay CR, Lanzavecchia A. Selective expression of the eotaxin receptor CCR3 by human T helper 2 cells［J］. Science, 1997, 277:2005～2007.
［17］ Bonecchi RG,Bianchi PP,Bordignon D, et al.Differential expression of chemokine receptors and chemokine responsiveness of type 1 T helper cells (Th1s) and Th2s［J］.J Exp Med,1998,187:129～135.
［18］ Loetscher PM,Uguccioni L,Bordoli M,et al. CCR5 is characteristic of Th1 lymphocytes［J］. Nature,1998,391:344～347.
［19］ Jourdan P,Abbal C,Nora N,et al.Cutting edge:IL-4 induces functional cell-surface expression of CXCR4 on human T cells［J］. J Immunol,1998,160:4153～4158.
［20］ Pernis AS, Gupta KJ, Gollob E , et al. Lack of interferonγ receptor β chain and the prevention of interferon γ signalling in Th1 cells［J］. Science,1995,269:245～247.
［21］ Manetti R, Annunziato F, Biagotti R, et al. CD30 expression by CD8+ T cells producing type 2 helper cytokines. Evidence for large numbers of CD8+CD30+ clones in human immunodeficiency virus infection［J］. J Exp Med, 1994, 180:2407～2411.
［22］ Weller PF, Lim K, Wan H-C, et al. Role of the eosinophil in allergic reactions［J］. Eur Respir J, 1996, 9:suppl.22, 109s～115s.
［23］ Prussin C. Cytokine flow cytometry:understanding cytokine biology at the singel-cell level［J］. J Clin Immunol, 1997, 17:195～204.
［24］ Thomas J, Schauer U, Heusser C, et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry［J］. J Immunol Methods, 1993, 159:197～207.
［25］ Jacob MC, Favre M, Bensa JC. Membrane cell permeabilization with saponin and multiparametric analysis by flow cytometry［J］. Cytometry, 1991, 12:550～557.
