T 细胞亚群的分离纯化

基 本 方 案 间 接 淘 洗 法 分 离 T 细胞亚群

材 料

亲和纯化的人免疫球蛋白吸附的羊抗鼠 Ig (Tago)

0.05m ol/L Tris •Cl，pH9. 5

抗 CD 8 抗体或其他特异性小鼠抗体（多克隆或单克隆；如 Coulter 或 Becton Dickinson)

PBS

总 T 细 胞（见辅助方案 1 或 2)

含 5 % 和 1 % (V A O 热灭活 FCS (56°C ， Ih) 的 PBS

R PM I 完 全 培 养 基（无血清，经过滤保持无菌）

15 mmX IOOmm 塑料培养皿，细 菌 学 级 别（非组织培养用）

15m l 离心管

Beckman GPR GH-3. 7 水 平 转 头 离 心 机（或者其他同类产品）， 4〜10°C

4°C 的台式摇床

倒置显微镜

无菌细胞刮

1.用 pH9. 5 的 0•05m ol/L Tris • Cl 稀释羊抗鼠 Ig 至 10 ug/ml， 取 IOml 加入 15 mmXIOOmm 培养皿，轻轻晃动使之覆盖平皿底面，室 温 孵 育 40 min， 或 者 4 °C 孵 育 24 h。

备 选 方 案 抗 体 依 赖 补 体 介 导 的 细 胞 毒 作 用 分 离 T 细胞亚群

T 细胞中某一亚群可以通过与特定抗体结合而被去除，本 方 案 使 用 的 是 抗 C D 4抗体。

附 加 材 料

新 生 家 兔 补 体（Cedarlane 实验室），禁止反复冻融

R P M I -I 完全培养基

抗 C D 4 抗体或者其他特异性小鼠抗体（多克隆或单克隆抗体；必须是补体结合的IgG2a 或 I g M ; 如 Coulter 或 Becton Dickinson)

1.检测新生家兔补体对人单个核细胞非特异毒性的情况。确定能够产生最大抗体介导的细胞毒性和最小非特异细胞毒性（如不加入特异性抗体时细胞溶解）所需的补仅的 浓 度（通 常 为 2 0 % 〜5 0 % ) 。

2.确定标记单个核细胞所需抗体量，用于流式细胞仪检测。

3.将 IO⁶〜IO⁷ 个 T 细胞加入离心管， 18〜20°C ， 400 g 离 心 lOmin。 弃上清，重悬细胞

辅 助 方 案 1 应用神经氨酸酶处理的绵羊红细胞玫瑰花环形成法分离 T 细胞

材 料

悬 于 Alsever 溶液中的绵羊红细胞（S R B C ; Colorado Serum)

H B S S

l U / m l 神 经 氨 酸 酶（低压冻干的粉末， X 型 ； Sigma) 溶 于 PBS (附 录 I); I m l 分装保存于一 20°C

R P M I -10 完全培养基

溶 于 R P M I -10 完全培养基中的 P B M C (I X IO⁷ 个细胞/m l ; 单 元 8.1 )

胎 牛 血 清（F C S ; 56°C 热 灭 活 Ih)

聚蔗糖-泛影葡胺溶液

A C K 裂 解 液（可选用）

Beckman G P R G H -3. 7 水 平 转 头 离 心 机（或者其他同类设备）

15m l 和 50m l 圆 锥 底的离心管（如 Falcon)

15m l 圆 底 离 心 管（如 Falcon)

1.在 50m l 离心管中加入 15〜25m l 悬 浮 于 Alsever 溶 液 中 的 绵 羊 红 细 胞（S R B C )，再加 满 H B S S ， 18〜20°C ， IOOOg 离 心 10 min。弃 上 清 ，用 H B S S 重 悬 细 胞 ，再次离
心 ，并重复洗一次。保存洗过的 S R B C 2〜3d 。

2 . 将 Iml S R B C 混悬液加入 50m l 离心管，并 加 入 I m l 溶 于 P B S 的 l U /m l 神经氨酸酶，用移液管吹匀细胞， 37°C 水 浴 孵 育 lh。

3.加满 H B S S ，用上述方法离心，弃上清，重 复 洗 2 次 。加 入 49 ml R P M I -10 完全培养基 重 悬 细 胞（S R B C 终浓度为 2 % ， V /V )。 4°C 保 存 直 至 使 用（5〜7d)。

4.将<≤2 X 10⁷P B M C 加 入 15m l 圆底离心管， 18〜20°C ， 400 g 离 心 10 min。弃 上 清 ，R P M I -10 重悬细胞使其浓度为 I X IO⁷ 个细胞/m l 。

5 . 每 I X I O ⁷ 个细胞/ml P B M C 加 入 2m l 热灭活的 F C S 和 2m l 神经氨酸酶处理过的 S R -B C ， 37°C 水 浴 孵 育 lh。 4°C ， 200 g 离 心 5 min。冰上孵育 Ih(无需弃上清）。