材料与仪器
细胞内因子 抗体
PMA 贮存液 依诺霉素贮存液 莫能星 RPMI-1640 破膜剂
PMA 贮存液 依诺霉素贮存液 莫能星 RPMI-1640 破膜剂
步骤
一、检测试剂
1. PMA 贮存液：PMA 溶于 DMSO，浓度为 0.1 mg/mI，-20℃ 保存，工作液贮存液 1：100 稀释于 RPMI-1640 或 PBS（无菌，无叠氮钠）中，此时为 1 ug/ml，工作浓度为 25 ng/ml，取 25 ug/ml 原液稀释即可。
2. 依诺霉素贮存液：依诺霉素溶于 DMSO，浓度为 1 mg/mI，-20℃ 保存；工作液：贮存液 1：20 稀释于 RPMI-1640 或 PBS（无菌，无叠氮钠）中，此时为 50 ug/ml，工作浓度为 1 ug/ml，取 20 ug/ml 原液稀释即可。
3. 莫能星 (monensin): 贮存液：莫能星溶于甲醇，浓度为 50 mg/mI，为加速溶解，可置于 40~43℃ 水浴。4℃ 只少保存 4 个月；工作液：贮存液 1：50 稀释于 RPMI-1640 或 PBS（无菌，无叠氮钠）中，此时为 1 mg/ml；工作浓度为 1.7 ug/ml（取 17 ul/ml）。
4. RPMI-1640，RPMI-1640 含 10% FCS（胎牛血清），2 mmol/L 谷氨酰胺 50 ug/ml 青霉素，50 ug/链霉素和 100 ug/ml 新霉素。
抗体：细胞表面标志抗体；CD3-PC5（PerCP），CD8-FITC。
细胞内因子：IL-4-PE，IFN-Y 等。
破膜剂：可用美国 Caltag 公司的 Fix & Perm 破膜剂；美国 BD 公司的 FACS 破膜剂；法国 Immunotech 公司的 IntraPrep 破膜剂。
二、检测步骤
1. 肝素抗凝采血。
2. 取 2 只试管，分别作为阴性对照管 (A 管) 和测定管 (B 管)，于 2 只试管中均加入 100 uI 血液和 100 uI PRM1-1640。
3. A 管中加入 3.4 ul 1 mg/ml 的莫能星工作液，B 管中加入：5 uI 1 ug/ml 的 PMA 工作液+4 uI 50 ug/ml Ionomycin 工作液+3.4 ul 1 mg/ml 莫能星工作液。
4. 37℃，5% CO2 培养箱培养 4~6 h。
5. 混匀，取出 100 uI，加入适量 CD3-PC5（PerCP），CD8-FITC，孵育一段时间（参阅抗体说明书）。
6. 用破膜剂固定和破膜。
7. 加入适量 IL-4-PE，IFN-y PE，孵育一段时间 (参阅抗体说明书)。
8. PBS 洗一次，去上清；适量 PBS 重悬细胞沉淀，上机检测。
三、结果分析
1. 用 CD3 设 门，选定 T 淋巴细胞。
2. 用 CD8 分别和 IFN-γ建立双参数直方图对第一步所确定的淋巴细胞进行分析。
3. 得出 CD8/IFN-γ+（Th1）和 CD8-/IL-4+（Th2）细胞百分含量。
1. PMA 贮存液：PMA 溶于 DMSO，浓度为 0.1 mg/mI，-20℃ 保存，工作液贮存液 1：100 稀释于 RPMI-1640 或 PBS（无菌，无叠氮钠）中，此时为 1 ug/ml，工作浓度为 25 ng/ml，取 25 ug/ml 原液稀释即可。
2. 依诺霉素贮存液：依诺霉素溶于 DMSO，浓度为 1 mg/mI，-20℃ 保存；工作液：贮存液 1：20 稀释于 RPMI-1640 或 PBS（无菌，无叠氮钠）中，此时为 50 ug/ml，工作浓度为 1 ug/ml，取 20 ug/ml 原液稀释即可。
3. 莫能星 (monensin): 贮存液：莫能星溶于甲醇，浓度为 50 mg/mI，为加速溶解，可置于 40~43℃ 水浴。4℃ 只少保存 4 个月；工作液：贮存液 1：50 稀释于 RPMI-1640 或 PBS（无菌，无叠氮钠）中，此时为 1 mg/ml；工作浓度为 1.7 ug/ml（取 17 ul/ml）。
4. RPMI-1640，RPMI-1640 含 10% FCS（胎牛血清），2 mmol/L 谷氨酰胺 50 ug/ml 青霉素，50 ug/链霉素和 100 ug/ml 新霉素。
抗体：细胞表面标志抗体；CD3-PC5（PerCP），CD8-FITC。
细胞内因子：IL-4-PE，IFN-Y 等。
破膜剂：可用美国 Caltag 公司的 Fix & Perm 破膜剂；美国 BD 公司的 FACS 破膜剂；法国 Immunotech 公司的 IntraPrep 破膜剂。
二、检测步骤
1. 肝素抗凝采血。
2. 取 2 只试管，分别作为阴性对照管 (A 管) 和测定管 (B 管)，于 2 只试管中均加入 100 uI 血液和 100 uI PRM1-1640。
3. A 管中加入 3.4 ul 1 mg/ml 的莫能星工作液，B 管中加入：5 uI 1 ug/ml 的 PMA 工作液+4 uI 50 ug/ml Ionomycin 工作液+3.4 ul 1 mg/ml 莫能星工作液。
4. 37℃，5% CO2 培养箱培养 4~6 h。
5. 混匀，取出 100 uI，加入适量 CD3-PC5（PerCP），CD8-FITC，孵育一段时间（参阅抗体说明书）。
6. 用破膜剂固定和破膜。
7. 加入适量 IL-4-PE，IFN-y PE，孵育一段时间 (参阅抗体说明书)。
8. PBS 洗一次，去上清；适量 PBS 重悬细胞沉淀，上机检测。
三、结果分析
1. 用 CD3 设 门，选定 T 淋巴细胞。
2. 用 CD8 分别和 IFN-γ建立双参数直方图对第一步所确定的淋巴细胞进行分析。
3. 得出 CD8/IFN-γ+（Th1）和 CD8-/IL-4+（Th2）细胞百分含量。
来源：丁香实验
