IPTG 诱导蛋白表达实验

1.外源基因的诱导表达：      1) 用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因；      2) 按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中；      3) 分别挑取单菌落接种于5mL LB ( 0.1g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃培养过夜；      4) 以2%体积比转接于2ml LB( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5 hr，至细菌对数生长期，加0.1mmol/L IPTG 2μl诱导3-4hr，同时设立不加IPTG诱导作为对照；       5) 取上述菌液1mL，12000rpm离心10min，收菌沉淀；      6) 重悬于冰的100μl PBS中，加入PMSF至终浓度为10 mmol/L。震荡器震荡混匀，加入2×加样缓冲液，煮沸10min变性，12,000rpm离心10min；      7) 分别取诱导前和诱导后的样品10 μl进行SDS-PAGE电泳分析。 2.大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化：      细菌的裂解      常用方法有：① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等.前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛.下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤.      酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著.主要步骤为：      4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL ).弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀.

注意事项：培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：25 μl/3 ml(24 mg/ml)。含有IPTG的培养基4℃避光保存，须在1~2 周内使用。 保存：IPTG要2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室温可放置一个月。远离热源及氧化剂。