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细胞增殖检测实验

实验分类:

细胞实验

最新修订时间:

简介

细胞增殖实验最常用的测定方法,包括:直接计数法、3 H-TdR 掺入法、MTT 法、BrdU 法以及应用 CFSE 测定细胞增殖等,特殊细胞的形态学检测法(如 T 淋巴母细胞)也可用于细胞增殖情况测定,近年来以 BrdU 掺入法和 CFSE 染色流式细胞术检测法较为普遍。


目前,用于细胞增殖检测实验的方法主要有 5 种:直接计数法、BrdU 检测法、CFSE 染色法、3 H-TdR 掺入法和噻唑蓝比色法

原理

直接计数法检测细胞增殖的基本原理是正常健康的细胞能够排斥锥虫蓝,而这种染料却能够扩散到细胞膜完整性被破坏的细胞中。

BrdU 检测法检测细胞增殖的基本原理是 5-溴-2'-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)是 DNA 前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入 S 期细胞单链 DNA 核苷酸序列替代胸腺嘧啶。增殖期的细胞需要大量核苷酸,因此可以吸收加入到培养液中的 BrdU,进而固定与 BrdU 结合的细胞,用相应的抗体(抗-BrdU-POD)与细胞上的 BrdUFab 段特异性结合后,可以使发光底物显色,应用荧光化学发光分析仪检测发光强度即可判定细胞增殖水平,也可应用荧光素标记抗体,流式细胞术进行检测。

CFSE 染色法检测细胞增殖的基本原理是 CFSE 一旦进入细胞后不能从细胞中释出,也不会被代谢降解,细胞中 CFSE 含量减少的唯一途径是通过细胞增殖分裂。当细胞分裂时,CFSE 标记物可平均地分配到两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。使用 CFSE 对淋巴细胞进行标记,结合流式细胞技术可以快速、准确地检测某一特定亚群的淋巴细胞的增殖。

3 H-TdR 掺入法检测细胞增殖的基本原理是淋巴细胞经有丝分裂原激活后,进入细胞周期进行有丝分裂。当细胞进入 S 期后,细胞合成 DNA 明显增加,DNA 合成需要大量的核苷酸,在培养液中加入 3 H 标记的 DNA 合成原料胸腺嘧啶脱氧核苷(H-TdR),则 3 H-TdR 作为合成的 DNA 原料被摄入细胞,掺入新合成的 DNA 中,根据放射性核素掺入细胞的量可以推测淋巴细胞增殖情况。

噻唑蓝比色法检测细胞增殖的基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜(formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂能溶解细胞中的甲臜,用酶联免疫检测仪在 570nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT 结晶形成量与活细胞数成正比。


来源:丁香实验团队

操作方法

直接计数法检测细胞增殖

直接计数法是一种粗略估算细胞存活率的方法,借助细胞对染料锥虫蓝的排斥作用可以测定细胞群体中活细胞的数目。

BrdU 检测法检测细胞增殖

5-溴-2'-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)是 DNA 前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入 S 期细胞单链 DNA 核苷酸序列替代胸腺嘧啶。近几年来,作为非放射性标记物,BrdU 可替代 H-TdR,避免了放射性污染问题,并同时具有敏感、简单和迅速的优点,因而用途十分广泛,对研究细胞动力学有重要意义,在肿瘤增殖细胞研究中有着特殊价值。

CFSE 染色法检测细胞增殖

荧光染料 CFSE,也称 CFDA SE(5,6-carboxyflu- orescein diacetate,succinimidyl ester)即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂,是一种可穿透细胞膜的荧光染料。

3H-TdR 掺入法检测细胞增殖

3H-TdR 掺入法又称放射性核素标记法,具有客观、准确、重复性好的特点,但需一定的设备,并且放射性核素对环境有污染,需要特殊处理。

噻唑蓝比色法检测细胞增殖

MTT,化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名为噻唑蓝。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选以及肿瘤放射敏感性测定等,但不适用于 CTL 等的检测。它的特点是灵敏度高、经济。缺点:由于 MTT 经还原所产生的甲臜产物不溶于水,需溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害

EdU 试剂盒检测细胞增殖

1、检测体系准备:(1)可检测 96 孔板、48 孔板、12 孔板、6 孔板等不同细胞培养板的细胞,检测体系根据需要按比例调整。(2)可检测贴壁细胞和悬浮细胞。悬浮细胞则需要增加离心步骤,其他反应步骤同贴壁细胞。2、接种细胞(贴壁细胞为例):取对数生长期的细胞消化后,用完全培养基重悬细胞至密度为 2×105 个/ml,准备 96 孔板,每孔接种 100 μl 细胞悬液(每孔接种量为 1×104 个

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