简介
直接计数法是一种粗略估算细胞存活率的方法，借助细胞对染料锥虫蓝的排斥作用可以测定细胞群体中活细胞的数目。
材料与仪器
器材：水平离心机、显微镜。
试剂：
① 磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.2—7.4。
② 胰蛋白酶工作液。
③ 0.4％ 锥虫蓝染液。
步骤
直接计数法检测细胞增殖的基本过程可分为如下几步，本方法以检测肿瘤细胞（T 淋巴瘤细胞 Jurkat，B 淋巴瘤细胞 Raji）为例：
A. 用胰蛋白酶工作液处理细胞并在无菌操作下将 0.5 ml 细胞稀释至细胞浓度为 2x105 个/ml—4x105 个/ml。
B. 在无菌操作下将 0.5 ml 上述稀释的细胞转移到一支新试管中，加 0.5 ml 的 0.4％ 锥虫蓝溶液。
C. 细胞在染料溶液中滞留的时间应在 3—10 分钟之内，用移液器吸取 20μl 样品并通过毛细作用加到血细胞计数板上。
D. 计数细胞总数不少于 500 个，蓝色的细胞要分别计数，确定蓝色细胞即没有染料排斥作用细胞的频率。
E. 由不具染料排斥作用细胞的数目确定细胞存活百分率。
注意事项
1. 制备细胞悬液，并做 50 倍稀释。
2. 用移液器吸取两份待计数的细胞悬液样品，通过毛细作用使之充满计数板和盖片间的空隙。分别加到血细胞计数板的两个计数室中（图 16-1）。
3. 低倍镜下查出四个大方格（每一大方格含 16 个小格）的总细胞数（X）。
4. 算出每个大方格的细胞数：Y＝X/4。
5. 每个大方格的体积 V＝1 mmx1 mmx0.1 mm＝0.1 mm3=10-4 ml。
6. 制备的细胞悬液的细胞浓度（个/ml）＝Yx104x 稀释倍数（50）
来源：丁香实验
