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EdU 试剂盒检测细胞增殖

相关实验:细胞增殖检测实验

最新修订时间:

丁香实验推荐阅读

合作专家 | 唐婕妤硕士

临床医学 中南大学

丁香实验推荐阅读

审核专家 | 郭雅婕博士

生物化学分子生物 中国科学院大学

原理

EdU 中文名为 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷,是一种新型胸腺嘧啶脱氧核苷类似物,可在 DNA 复制过程中替代胸苷掺入到新合成的 DNA 中。EdU 的乙炔基可与荧光或生物素标记的叠氮化物发生共价反应,形成稳定的三唑环,从而通过荧光检测到细胞增殖。

用途

用于细胞增殖、分化、生长与发育、DNA 损伤修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究,适合 siRNA、miRNA、小分子化合物及药物的筛选实验。

材料与仪器

96 孔板或 6 孔板等细胞培养板、EdU 试剂盒(建议选择成熟的试剂盒,内含 EdU、荧光探针或生物素探针、反应液、Hoechst 等试剂)、PBS、固定液(成熟的免疫染色固定液或者是 4% 多聚甲醛)、渗透剂(0.5% TritonX-100)、去离子水或超纯水、荧光显微镜/激光共聚焦显微镜/流式细胞仪/荧光酶标仪等检测设备。

步骤

1、检测体系准备:

(1)可检测 96 孔板、48 孔板、12 孔板、6 孔板等不同细胞培养板的细胞,检测体系根据需要按比例调整。

(2)可检测贴壁细胞和悬浮细胞。悬浮细胞则需要增加离心步骤,其他反应步骤同贴壁细胞。

2、接种细胞(贴壁细胞为例):

取对数生长期的细胞消化后,用完全培养基重悬细胞至密度为 2×105 个/ml,准备 96 孔板,每孔接种 100 μl 细胞悬液(每孔接种量为 1×104 个细胞),放置 37 ℃ 恒温细胞培养箱培养过夜待细胞贴壁。

3、根据实验需要对细胞进行药物处理或其他刺激处理等。

4、EdU 标记:

(1)用完全培基稀释 EdU 至 20 µM,96 孔板中每孔加入 100 µl 稀释好的 EdU 工作液,使其终浓度为 10 µM(对于大部分细胞来说适合的浓度),37 ℃ 继续孵育 2 小时,细胞孵育时间的长短取决于细胞生长速度,对于常见的细胞类型,一般孵育 2 小时即可。

(2)去除细胞培养基,用 PBS 洗涤 1~2 次,每次 3 分钟。

5、固定细胞:

(1)细胞固定:去除洗涤液,每孔加入 50 μl 4% 多聚甲醛室温固定细胞 30 min。

(2)去除固定液,用 PBS 洗涤 3 次,每次 3~5 分钟。

(3)去除 PBS,每孔加入 100 µl 通透液(0.5% TritonX-100 的 PBS)在室温下孵育 10~15 分钟。

(4)去除通透液,用 PBS 洗涤 1~2 次,每次 3~5 分钟。

6、染色(避光):

(1)按照试剂盒说明配置反应液,对于 96 孔板,每孔加入 50 µl 反应液,轻轻摇晃培养板以确保反应液均匀覆盖样本,在室温下避光孵育 30 分钟。

(2)去除反应液,PBS 洗涤 3 次,每次 3~5 分钟。

7、细胞核染色(避光):

(1)去离子水稀释 Hoechst33342 反应液至 1×,去除 PBS 洗涤液后,每孔加入 100 µl 1× 的 Hoechst33342,室温避光染色 10 分钟。

(2)去除 Hoechst,用 PBS 洗涤 3 次,每次 3~5 分钟。

8、计数和拍照:

在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察 EdU 标记和未标记的细胞,拍照并计数。

实验需进行三次重复,实验中的每个组需设有至少三个复孔。最后采用统计软件进行数据的分析。

9、流式细胞仪或荧光酶标仪检测:

对于步骤 6 或者 7 获得的细胞悬液样品,可进行流式检测或酶标仪检测。对于流式仪,检测过程中使用低流速,使用未经 EdU 标记的细胞作为阴性对照。流式仪和荧光酶标仪检测中的激发波长和发射波长根据试剂盒中的荧光探针确定。

注意事项

1、接种细胞量可依据细胞生长速度、实验处理的要求调整,一般以 4×103~1×105 为宜,不宜过挤,以免影响细胞周期,导致阳性信号减少,影响实验准确性。

2、细胞接种至 96 孔板时,为避免液体蒸发,周围一圈孔可不种植细胞,而以同体积的 PBS 或培养液代替。

3、稀释 EdU 需使用完全培养基,以免细胞缺少营养导致细胞周期阻滞。

4、每孔加入的 EdU 以能完全覆盖细胞为宜,孵育时间取决于检测的细胞的细胞周期,一般为细胞周期的 10% 左右,肿瘤细胞大多数都为 2 小时,但人胚胎细胞仅需 5 分钟,而人神经细胞需 1 天。温度、湿度和培基条件等可能对细胞周期产生影响,重复实验时需尽量确保上述条件一致。

5、EdU 浓度取决于孵育时间,细胞类型,细胞密度等。短时间(< 45 分钟)宜提高EdU 浓度,长时间(> 24 小时)建议适当减低 EdU浓度。对于 A549,HeLa,3T3 等贴壁细胞,一般 EdU 终浓度为 10 µM,但对于不常见的细胞类型或未操作过的细胞类型,初次检测建议对 EdU 使用浓度进行摸索。

6、计数时需计数染色信号与核染色信号完全重合或者与核重合信号明显强于胞浆的信号,这是真正的阳性信号。

7、为减少背景干扰,洗涤次数和时间都要足够。

8、调试机器时,尽量将曝光时间控制在 30 ms,尽量 < 1s,以免过曝影响实验准确性。

9、对于悬浮细胞的处理:悬浮细胞同样的方法进行 EdU 标记以后,需进行细胞涂片,然后 4% 多聚甲醛固定,或者增加离心步骤,后面步骤和贴壁细胞一致。

10、染色反应液现用现配,需严格按照顺序和比例配制,否则可能无法有效进行共价反应,若出现试剂颜色变化,则说明该组分可能已失效,应当弃用。反应液配制后尽快使用,最好 15 分钟内使用。

11、细胞核染色非必须步骤,如果无特殊要求,即可在荧光显微镜下观察,或者用流式细胞仪,酶标仪等检测。

12、根据实验需求自行选择检测方式,如显微镜检测、酶标仪检测或流式仪检测等。

13、EdU 试剂盒法含荧光染料,注意和其他荧光染料的不相容性。对于 GFP、RFP、mCherry 等荧光蛋白,如果需要同时进行这两种不同的实验操作,这些荧光蛋白的染色实验需要在 EdU 反应实验前进行操作和检测。

来源:丁香实验

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