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细胞增殖检测:BrdU

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5-brdu 的分子量为307.1,将100mg分为三份30.7mg(0.1mmol),溶于1ml三蒸水,分装-20度保存。用的时候再稀释100倍,如在1ml溶液里加入10ul即可。尽量分装为小剂量,如100ul,避免反复冻融使其活性降低。

1、BudR贮存液的配制

BudR 5mg(先用0.5ml 1N NaOH溶解)然后加蒸馏水至5ml,即成1000ug/ml的贮存液,因BudR遇光会发生分解,贮存液需置棕色瓶并黑纸封瓶避光冰冻保存。 一般用的是用10μg/ml终浓度。

2、终止细胞培养前,加入BrdU(终浓度为30μg/L),37℃,孵育40min。

3、弃培养液,玻片用PBS洗涤3次。

4、甲醇/醋酸固定10min。

5、经固定的玻片空气干燥,0.3%H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。

6、5%正常兔血清封闭。

7、甲酰胺100℃,5min变性核酸。

8、冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清。

9、按ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数(LI)。

细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35ml培养皿中(内放置一盖玻片),培养1天,用含0.4%FCS培养液同步化3天,使绝大多数细胞处于G0期。

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