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BrdU检测法检测B细胞增殖

相关实验:B细胞增殖的检测

最新修订时间:

简介

5-溴-2'-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。


增殖期的细胞需要大量核苷酸,因此可以吸收加入到培养液中的BrdU,进而固定与BrdU结合的细胞,用相应的抗体(抗-BrdU-POD)与细胞上的BrdUFab段特异性结合后,可以使发光底物显色,应用荧光化学发光分析仪检测发光强度即可判定细胞增殖水平,也可应用荧光素标记抗体,流式细胞术进行检测。



近几年来,作为非放射性标记物,BrdU可替代H-TdR,避免了放射性污染问题,并同时具有敏感、简单和迅速的优点,因而用途十分广泛,对研究细胞动力学有重要意义,在肿瘤增殖细胞研究中有着特殊价值。

原理

BrdU检测法检测B细胞增殖的基本原理是利用BrdU通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶,增殖期的细胞吸收加入到培养液中的BrdU,进而固定与BrdU结合的细胞。


用相应的抗体(抗-BrdU-POD)与细胞上的BrdUFab段特异性结合后,使发光底物显色,再用荧光化学发光分析仪检测发光强度即可判定细胞增殖水平,也可用荧光素标记抗体,流式细胞术进行检测。

材料与仪器

试剂:


1.BrdU标记试剂
2.FixDenat液
3.Anti-BrdU-POD反应液

4.抗体稀释液、洗涤液和底物等


仪器:


1. 细胞培养箱
2. 荧光化学发光分析仪

步骤

BrdU检测法检测B细胞增殖的基本过程可分为以下几步(应用ELISA方法测定细胞的增殖水平,采用BrdU试剂盒检测):


1.已接种到96孔板的细胞在相应抗原刺激1~5天后,加入BrdU(10 μl/孔·100 μl培养液),细胞培养箱中共同孵育2~24小时。


2.室温下,2000/min,15分钟离心,除去培养液。


3.加入200 μl/孔FixDenat液,室温,30分钟固定细胞。尽量除尽固定液。


4.加入100μl/孔Anti-BrdU-POD反应液,室温放置90分钟。


5.200~300 μl/孔专用洗净液洗板3次,加入100 μl/孔底物溶液,室温反应5~10分钟。


6.利用荧光化学发光分析仪,波长450~655 nm处读取发光强度,结果用Ascent软件处理,采用Student’st检验,P<0.05示差异有统计学意义。

来源:丁香实验

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