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B细胞增殖的检测

实验分类:

免疫学实验

最新修订时间:

简介

B细胞在受到特异性和非特异性抗原等的刺激后,可诱导B细胞发生活化和增殖。


检测B细胞的增殖情况在一定程度上反映了B细胞的功能状态,其检测方法简便、可靠,主要有3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)及5-溴脱氧嘧啶核苷(Brdu)掺入法以及2-羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,6-carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE)染色法等。

原理

BrdU检测法检测B细胞增殖的基本原理是利用BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。


增殖期的细胞需要大量核苷酸,因此可以吸收加入到培养液中的BrdU,进而固定与BrdU结合的细胞,用相应的抗体(抗-BrdU-POD)与细胞上的BrdUFab段特异性结合后。


可以使发光底物显色,应用荧光化学发光分析仪检测发光强度即可判定细胞增殖水平,也可应用荧光素标记抗体,流式细胞术进行检测。


荧光染料CFSE染色法检测B细胞增殖的基本原理是利用CFSE是一种对细胞无毒副作用的脂类物质,可以穿过细胞膜与细胞骨架蛋白稳定结合,在胞质内某些酶的作用下水解而发荧光。


它可以被488 nm的激光所激发,发射波长为510~530 nm,近似于FITC。理论上认为,当细胞分裂时,CFSE被平均分到两个子细胞当中,因此子细胞所带的荧光量为母细胞的一半。


细胞分裂次数越多,细胞的荧光量越弱。利用FACS技术,将抗体标记与CFSE染色结合,可以测定特定细胞的增殖情况。


3H-TdR掺入法检测B细胞增殖的基本原理是淋巴细胞经有丝分裂原激活后,进入细胞周期进行有丝分裂。


当细胞进入S期后,细胞合成DNA明显增加,DNA合成需要大量的核苷酸,在培养液中加入3H标记的DNA合成原料胸腺嘧啶脱氧核苷(H-TdR),则3H-TdR作为合成的DNA原料被摄入细胞,掺入新合成的DNA中,根据放射性核素掺入细胞的量可以推测淋巴细胞增殖情况。

来源:丁香实验团队

操作方法

BrdU检测法检测B细胞增殖

5-溴-2'-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。增殖期的细胞需要大量核苷酸,因此可以吸收加入到培养液中的BrdU,进而固定与BrdU结合的细胞,用相应的抗体(抗-BrdU-POD)与细胞上的BrdUFab段特异性结合后,可以使发光底物显色,应用荧光化学发光分析仪检测发光强度即

荧光染料CFSE染色法检测B细胞增殖

荧光染料CFSE,也称CFDA SE(5,6-carboxyflu- orescein diacetate,succinimidylester)即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂,是一种可穿透细胞膜的荧光染料。CFSE一旦进入细胞后不能从细胞中释出,也不会被代谢降解,细胞中CFSE含量减少的唯一途径是通过细胞增殖分裂。当细胞分裂时,CFSE标记物可平均地分配到两个子代细胞中。因此其荧光强度是亲代细胞

3H-TdR 掺入法检测B细胞增殖

3H-TdR掺入法又称放射性核素标记法。淋巴细胞经有丝分裂原激活后,进入细胞周期进行有丝分裂。当细胞进入S期后,细胞合成DNA明显增加,DNA合成需要大量的核苷酸,在培养液中加入3H标记的DNA合成原料胸腺嘧啶脱氧核苷(H-TdR),则3H-TdR作为合成的DNA原料被摄入细胞,掺入新合成的DNA中。根据放射性核素掺入细胞的量可以推测淋巴细胞增殖情况。此方法客观、准确、重复性好,但需一定的设备,并

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