荧光染料CFSE染色法检测B细胞增殖

荧光染料CFSE，也称CFDA SE（5,6-carboxyflu- orescein diacetate，succinimidylester）即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料。

CFSE一旦进入细胞后不能从细胞中释出，也不会被代谢降解，细胞中CFSE含量减少的唯一途径是通过细胞增殖分裂。当细胞分裂时，CFSE标记物可平均地分配到两个子代细胞中。

因此其荧光强度是亲代细胞的一半。使用CFSE对淋巴细胞进行标记，结合流式细胞技术可以快速、准确地检测某一特定亚群的淋巴细胞的增殖。

荧光染料CFSE染色法检测B细胞增殖的基本原理是利用CFSE可以穿过细胞膜与细胞骨架蛋白稳定结合，在胞质内某些酶的作用下水解而发荧光。

它可以被488 nm的激光所激发，发射波长为510～530 nm，近似于FITC。理论上认为，当细胞分裂时，CFSE被平均分到两个子细胞当中，因此子细胞所带的荧光量为母细胞的一半。

细胞分裂次数越多，细胞的荧光量越弱。利用FACS技术，将抗体标记与CFSE染色结合，可以测定特定细胞的增殖情况。

试剂：

3. RPMI 1640完全培养液

仪器：

荧光染料CFSE染色法检测B细胞增殖的基本过程可分为以下几步：

1）淋巴细胞的制备：将Balb／c小鼠脱颈断髓处死，无菌分离颌下、双侧腋窝、锁骨下、腹股沟浅淋巴结和肠系膜淋巴结，去掉被膜，于200目不锈钢筛网上研磨、过滤，获得单细胞悬液。

收集细胞，用冷PBS离心（400 g，6分钟）洗涤细胞2次，悬浮于PBS中，调整细胞密度为2x10细胞／ml。取1 ml细胞悬液加入15 ml离心管中，准备进行CFSE染色。

（2）CFSE染色：CFSE用DMSO溶解成10 mmol／L的储存液，-20 ℃保存。临用前，取适量用PBS稀释成2 μmol／L的工作液，平衡至室温备用。

调整淋巴细胞悬液的密度为2x10⁶细胞／ml，加入等体积的CFSE工作液（终浓度为1 μmol／L），充分混匀后在室温条件下轻轻振荡10分钟。

然后用适量的RPMI1640完全培养液终止反应，离心（400 g，6分钟），洗涤细胞2次，弃上清，悬浮于RPMI 1640完全培养液中，并调整细胞密度为2x106细胞／ml。

（3）多克隆刺激剂诱导细胞增殖：将上述调整好细胞密度的淋巴细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔200 μl。

加入佛波醇酯类多克隆刺激剂PDB（终浓度2x10-7 mol／L）＋钙离子转运剂Ion（1 mg／L）或植物血凝素类多克隆刺激剂Con A（5 mg／L），刺激48小时后进行检测。

（4）流式细胞术检测淋巴细胞增殖：48小时后，取出培养细胞至流式管中，直接上机检测，检测通道为FL1。