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细胞增殖检测:MTT实验经验总结

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MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。

一、步骤

1、接种细胞

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul。

2、培养细胞

同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

3、呈色

培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。

4、比色

选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

二、注意事项

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,

IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!

三、举例

各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入计算公式:

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-undefined(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025

有一个公式可供参考;

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大剂量

I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

Pm:最大阳性反应率

Pn:最小阳性反应率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

例:

用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。

一般要低于IC50,避免非调亡性杀伤的细胞太多,造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50,作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%,用药后一般为5-10%(Annexin V),细胞周期的亚G0峰比较明显。

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