细胞增殖检测：MTT实验经验总结

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

一、步骤

1、接种细胞

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

2、培养细胞

同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3、呈色

培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4、比色

选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

二、注意事项

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！

三、举例

各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-undefined（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025

IC50=0.00025

有一个公式可供参考；

lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）

Xm：lg 最大剂量

I：lg（最大剂量/相临剂量）

P：阳性反应率之和

Pm：最大阳性反应率

Pn：最小阳性反应率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

例：

用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。

一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显。