原理
材料与仪器
人外周血T细胞
FCS-RPMI-1640培养液 谷氨酰胺 HEPES 青霉素 链霉素 PBSA缓冲液
离心机 分光光度计 摇床
FCS-RPMI-1640培养液 谷氨酰胺 HEPES 青霉素 链霉素 PBSA缓冲液
离心机 分光光度计 摇床
步骤
一、人外周血T细胞分泌IL-2的诱生
1. 人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为
2. 加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.51 ml，每孔再加PHA 0.5 ml，37度，5%CO2孵育48小时。
3. 回收上清：吸出细胞培养上清，12000 r/min 离心15分钟，收集上清，-20度冻存。
二、IL-2生物活性测定
1. CTLL-2细胞制备：取传代培养24~48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000 r/min 离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。
2. 加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1 ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1 ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100 ul 细胞+100 ul 培养液）。37度，5%CO2孵育40小时。
3. MTT掺入：轻轻吸取上清液100 ul，加MTT（1 mg/ml）100 ul，37度，5%CO2孵育2小时。
4. 测定：离心培养板，2000 r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100 ul DMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570 nm 测吸光值（A）。
5. 计算：用标准品浓度和对应的净A570 nm 值（实验孔-阴性对照孔的A570 nm值）绘制标准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。
注意事项
1. CTLL-2细胞存活率应大于95%。
2. 因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，最好采用抗IL-4 mAb吸附剂除去IL-4。
来源：丁香实验
