有关MTT

MTT有下面一些优点：

1、有灵敏度高，重复性好，

2、操作简便、经济、快速、易自动化的优点，

3、而且没有3H—TdR掺入试验放射性污染，

4、还可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素

所以可以选择这种实验方法

丁香园网友jiangql的观点为：

MTT 理论可以参见司徒镇强，吴军正主编. 细胞培养. 西安：世界图书出版社. 1996.

MTT，3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 四唑盐. 实验结束前，如杀伤实验或生存曲线培养48h后，加入5mg/mL的MTT 10μL，继续培养4h后离心弃上清，加入DMSO150μL溶解MTT，选择490nm或550nm波长，在酶联免疫检测仪上测定OD值。

有三点体会：

1、MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。

2、贴壁细胞效果好，悬浮细胞要离心2500rpm×10min，室温, 再吸去培养液，加入DMSO。

3、如果实验孔不多，DMSO加入后可以用枪头吹打混匀，比振荡溶解效果好。

丁香园网友Seattle78的观点为：

MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT，原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶formazan，后者的产量与活细胞数成正相关。formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长560nm进行比色。所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。

优点：灵敏度高，操作简便，自动化。

缺点：影响因素多，重复性较差。

注意：MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护。

丁香园网友Midas的观点为：

以下的protocol供参考：

1. Make a solution of 5 mg/mL MTT1 dissolved in PBS and filter sterilized.

2. 5 hours before the end of the incubation add 20 uL of MTT solution from step one to each well containing cells.

3. Incubate the plate in a CO2 incubator at 37 oC for 5 hours.

4. Remove media with needle and syringe.

5. Add 200 uL of DMSO to each well and pipette up and down to dissolve crystals.

6. Put plate into the 37 ºC incubator for 5 minutes.

7. Transfer to plate reader and measure absorbance at 550nm

丁香园网友goodfreecn：

四唑盐(MTT)比色试验

（1）MTT溶液：称取250mg MTT，放入小烧杯中，加50ml；PBS(0．01mol／L，pH7．4)在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存。两周内有效。

（2）含l0％胎牛血清RPMl 1640培养液、o．25％胰蛋白酶二甲基亚砜(DMSO)(使用分析纯产品)

（3）96孔培养板(单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板)、可调移液器、吸管、离心管、计数板

（4）孵箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪

【步骤】

（1）接种细胞：用o．25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含 10％胎牛血清的RPMlt604培养液配成单个细胞悬液，以每 孔100－1000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。

（2）培养细胞；将培养板移入COz孵箱中，在37℃、5％CO2：及湿度条件下，培养3—5天．(培养时间取决于实验目的和要其求)

（3）呈色：培养第2—5天后，每孔加入MTT溶液(5mg／m1)20ul，37℃，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对：浮生长的细胞，需离心,(1000rpm．5min)，然后弃去孔内培养每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。

（4）比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线。

【注意事项】

（1）选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有lo‘个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。

（2）避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于lo％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

（3）设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白孔。其它试验步骤保持一样。最后比色时，以空白孔调零。

丁香园网友Frederic俄观点为：

MTT原理简单说就是：MTT能被活细胞的酶作用，从而发生变色，变蓝！！

用OD550/OD490策的吸光度，活细胞多则吸光度大，反之则吸光度小。从而反映出你的细胞的死亡率，即药物的作用！

用来检测凋亡，用于抗肿瘤药物的筛选，在美国的很多公司，也用它来粗筛！

我就做过肿瘤药物的筛选，很方便，96孔板做机组不同的药物浓度，分设阳性药物、阴性对照（也作不同梯度），对比结果既可！

我觉得其中的难点是：

1、细胞分板时，要充分分散，而且要家几个空就重新吹散一次，否则，细胞浓度就会不同。（我曾经试验过，用后加的孔作试验组与用先加的孔作对照组，结果有些差异，也许是我的熟练程度不行！）另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。

2、培养后，细胞的培养既要吸干净，否则，残留的蛋白会对ＭＴＴ有一定的吸附作用，影响就过准确性。我使用的是翻转法，将培养液倒掉，这样做很简便，又很快洁。重复性也不错。

3、测吸光度值要有一定的时间范围，在测定是你会发现，随着时间的推移没空都会变深些，（这可能是由于ＭＴＴ在空气中氧化的结果，我记不清了，你再找找书，另外，具体时间我也没有记清）

4、养性药物的选择，要选择经典的，有说服力的，又对你的细胞有很好的杀伤了力的药物。别认为简单，我就曾经因为阳性药物选择错误而重新做试验，惨痛的教训呀！！

丁香园网友Gujun的观点为：

我读书时应用MTT作肿瘤细胞株药敏，采用以下文献“周建军，乐秀芳，韩家娴，等。评价抗癌物质活性的改良MTT方法。中国医药工业杂志 1993；24（10）：455-6”。该方法为上海中科院细胞所所采用，MTT产物应用三联液溶解彻底，不需振荡，对于悬浮细胞尤其适合，且产物稳定。对于贴壁细胞，他们那时采用SRB方法。

简要方法（我的肿瘤药敏实验）：

1、将一定密度的肿瘤细胞90μl/孔接种于96孔微量培养板内,然后加入药液10μl/孔,每种药5个浓度(每个浓度相差10倍),一个浓度设4个复孔。每块板设一个空白调零孔,内加培养液，不含细胞与药物。每种细胞设6个正常对照孔,加样100μl/孔，不含药物。接种完毕后在37℃， 5%CO2条件下孵育培养48小时。

2、加MTT：加MTT溶液(5mg/ml)20μl/孔,混匀后37℃，5%CO2 条件下孵育4小时。

3、加三联液：（三联溶解液：SDS 10g， 异丁醇 5ml ， 10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液），加溶解三联液100μl/孔，混匀后37℃放置过夜以溶解甲臢。

4、吸光度（A）测定：用酶标仪测定每孔吸光度，测定波长为570nm，校正波长为630nm。

5、计算：肿瘤抑制率=（对照组A值－治疗组A值）／对照组A值×100%， IC50值用Logit法计算。

丁香园网友Wizard回答淋巴细胞增殖

1、应避免稀释MTT，可去培养液，但为简便起见，可以用直接翻板法。翻板后，每孔大约残留液体20ul左右。，MTT最终浓度0.5-1mg/ml。

2、对于DMSO等有机溶剂溶解的时间不能过长，如10min就可以获得结果。

3、96孔细胞培养板接种细胞数应在（0.5-2）×10E4范围，细胞过多，会使MTT等完全降解或细胞拥挤不能单层生长，使光吸收度降低，影响结果。

MTT染色后，96孔板中的上清弃去后是否要用PBS洗一下再加DMSO？另外是用排枪吸去上清液呢，还是甩干即可？遇到不贴壁的细胞如何让细胞不流失？

丁香园网友eeflying的观点为：

MTT法是一种通过测定细胞能量代谢水平用以间接反映细胞增殖情况的检测方法。MTT全名四甲基偶氮唑盐，为淡黄色可溶性化合物，或细胞特别是增殖期细胞可通过线粒体能量代谢中的琥铂酸脱氢酶的作用使淡黄色的MTT分解，形成蓝色结晶状fomazan，沉积于细胞内或细胞周围，形成量与细胞增殖状况成正比，直接地说，是与线粒体的呼吸状态成正比。

从上述机理可以得出：

1、不必洗，MTT与fomazan的颜色不同，吸光谱也不同，实际上我们测得是OD570的吸收光，你可以自己测一下，实际MTT的吸光度在此波长很小。其实fomazan对细胞是有害的，部分细胞就死掉了，formazan的结晶在其周围，要洗不就丢了？我们加DMSO,SDS,酸化异丙醇其实只是溶解剂。

2、到是必要注意酚红的影响，酚红是影响D值的测定，要设白对照组。

问题：悬浮细胞ｍｔｔ，何时加药物？细胞接种９６孔板时？？？

丁香园网友Lzchengfeng的回答为：

一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后24h），而悬浮细胞是上板同时加。

但是，我个人的经验，药物加的时机并不是固定的，具体要根据你实验本身的要检测的指标。如果你要做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因素。但是，如果你要检测的是其他一些指标，比如，如果你想做药物对细胞黏附功能的影响，可能就要在细胞贴壁 以前就要加药了。

丁香园网友eeflying的回答为：

贴壁细胞一般在试验前1-2日接入９６孔板，

太晚，细胞在传代后有一个１６小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓慢，及对数曲线的底部，此时的MTT数值太低了，

太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高，让试验时落在对数早中期最好。

问题：我现在在作星形胶质细胞药物作用后的MTT，但结果总是不理想，同一组的数值差别都特别大。请教各位，作MTT应该特别注意些什么？

丁香园网友wizard的回答为：

1、必须有适宜的效靶比，因为MTT是线粒体酶底物，效应细胞及靶细胞均能掺入，如果效应细胞数量太大，MTT掺入量太高，则不能有效地反映靶细胞的杀伤状态。

2、建议每一组均做一个空白对照，因浓度不同的底物可能会有不同的结果，如果只做一个空白对照可能会有影响。

丁香园网友ylcui的经验为：

我再谈些实际经验：

首先，加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。

其次，如果用96孔板，周围一圈孔的值由于液体蒸发和温度梯度原因，会误差很大，尽量不用。

最后，溶解甲臢时，如果是悬浮细胞或细胞贴壁不牢，尽量用酸性SDS溶解，不要弃去培养液，以免细胞损失。这还要求最后加入药物和MTT时，血清浓度低于10%。

对照问题

丁香园网友fengyouxin的观点为：

个人认为MTT中最重要的是背景对照，就是不加细胞的对照。这包括两方面内容，一是指与实验孔相同，对照孔中也加入相同体积的培养基，各做3-4复孔，取平均值，主要目的是为了减少培养基含有的酚红对比色的影响；二是要在对照孔内加入与实验孔相同成分和浓度的药物（特别是药物PH值为酸性或碱性时），同样也是为了减少比色时的误差。

还有人主张采用空白对照，典型的做法是再加DMSO时，将实验孔周围的各孔内都加上相同体积的DMSO，据说可以减少比色、读数的变异系数，但个人经验认为有没有无甚大碍。

1、测量波长的问题，我在文献上见有用490nm，还有用570nm，甚至还有选用其他波长的，不知波长的选择是根据什么做出来的？

2、我在文献（Freshney RI. Culture of animal cells：a manual of basic technique. Third Edition. A John Wiley & Sons, Inc, Publication. New York.1994.）中见到，在用DMSO溶解结晶紫以后，再加入Sorense‘s缓冲液（0.1M氨基乙酸，0.1MNaCl，用1MNaOH调节pH至10.5），不知Sorense’s缓冲液在此处是什么作用？

3、我是用DMSO溶解结晶紫的，我遇到一个老师，他说我这是一个老土的办法，建议我改用SDS，不知DMSO与SDS的区别在什么地方？有什么优缺点？

丁香园网友gujun的观点为：

关于波长的选择，我在实验前也查了不少资料，测定波长（measure absorbance）范围在550－ 600 nm，校正波长（measure absorbance）大于650 nm，根据你处仪器情况，具体选择。（我查到多数外文文献中提到的测定波长为570nm，校正波长为630nm。）这样选择的原因见附图，图中虚线部分为MTT紫外吸收光谱，实线为甲臢（formazan）吸收光谱，可见550－600nm为甲臢的吸收高峰，在该范围内测定可提高检测的敏感性，且避免MTT干扰。而选择校正波长是为了去除细胞碎片，指纹（？）或其他非特异因素造成的干扰（reduce background contributed by excess cell debris, fingerprints and other nonspecific absorbance.），当然你可以不选择校正波长，在国内的不少文章中，并没有选择校正波长，但国外文章一般都选择。再上传有关文章，见附件，正所谓言之有据。另外，我建议zhjrun兄有空再到pubmed等数据库中搜索有关文章，会有一个全面了解，不能只听一面之辞，我想作为一个研究人员应该这样。

关于选择490nm为测定波长，我看到文献中MTS作用产物最佳测定波长为490nm，若需要了解具体情况，也见所上传的附件。

另外在丁香园中也有MTT有关讨论，你可以去看看，我采用的是三联溶解液，在帖子中也提到，我当时是到中科院药研所请教有关老师的（不是细胞所），具体方法可见该帖中文献。

我做的MTT比较多，第一次听说这种情况，的确奇怪。是不是半胱氨酸与MTT可以发生反应？ 我想不会，因为相关文献上报道过用MTT法做homocysteine的细胞毒性实验。（请看链接中的几篇摘要：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=Display&DB=PubMed）。

个人认为，您的试剂或者操作有问题。下面给您几点建议：

1、首先搞清楚使用的MTT、homocysteine等试剂有无问题；

2、尽可能使用新的96孔板，特别注意，在37度4小时后，必须在1500rpm下离心十分钟，使沉淀完全，然后才可弃上清，加入DMSO。还有每孔内加入细胞的数量要适中。

3、细菌或霉菌等污染不能排除，理由：（1）加入MTT后很快出现紫色。应该不会。有的时候低度污染或是某些微生物污染的时候挺难发现，而且培养的细胞也能生长，这时候就容易出现上述现象，液体肯定是紫色的，倒上清时一块连细菌什么的都倒了，剩下的沉淀就少了，我想这时加入DMSO肯定是粉红色的；（2）单独把MTT加入同型半胱氨酸培养液后也出现紫色。这更是离谱。MTT的原理为活细胞内的线粒体脱氢酶将黄色的 可溶性四唑盐MTT还原为紫蓝色不溶结晶formazan，难不成您的培养液内有活细胞？所以我高度怀疑您的同型半胱氨酸培养液被污染了，建议取一点涂片，请一位老手看看，必要时送检验科做细菌培养。您不妨更换培养液试试。

4、生长曲线的测定不止MTT方法一种，直接细胞计数都行，只要认真操作准确性也差不了哪里去，有很多参考书上都有这个方法，在这里就不多说了。

请您按上述要求再做做看，无论什么结果都请继续跟帖讨论。

丁香园网友Myf的观点为：

真的很有意思。我请教了一位实验室的前辈，她也是第一次遇到这种现象。她认为不是污染的问题，因为将半胱氨酸培养液直接与MTT相加不到一分钟即可出现紫色，不用孵育，直接加入DMSO就出现粉色，而且其酶标值随浓度改变成弧形曲线。如果是污染的话，MTT与线粒体的酶结合也需要两小时以上。很快显色的原因，可能是半胱氨酸的巯基与MTT反应所致。建议我直接做细胞计数，用胎盘兰染色。不知道还有没有更简便准确易行的方法，以前介绍过的MTS行吗？真的很简便吗？大约需要多少钱？

可是我以同样的方法做细胞系,却没有这样的情况呀.在加入MTT前在倒置显微镜下观察该原代细胞见其密度及折光性都很好!!不知是否可能是这种情况:原代细胞的细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶没有类似于细胞系的活性??

丁香园网友Midas的问题为：

琥珀酸脱氢酶是琥珀酸氧化呼吸链（氧化呼吸链之一）里重要的复合酶之一，它位于线粒体的内膜上，催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，从而使FAD接受两个氢原子生成FADH2，然后再将氢传递给CoQ，生成CoQH2，继续呼吸链的电子传递过程。

所以说琥珀酸脱氢酶是细胞能量产生过程中重要组成酶之一，dancer786您说的“原代细胞的细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶没有类似于细胞系的活性??”不知道有没有其他的理论或实验根据，如果没有的话，就应该可以用MTT检测出琥珀酸脱氢酶的活性！

在下次重复实验时请注意：加入DMSO之前，在倒置显微镜下观察（BF），确保有紫色结晶形成。

以前我曾发过MTT的帖子，得到了各位老师的热心帮助，我非常感谢他们！我现在又遇到问题了，只好再次求助，盼望能继续得到大家的帮助。

96孔板每孔加入浓度为3X10（E6）的小鼠脾细胞100ul

然后加液如下：

第一行：高浓度胎盘肽100ul

第二行：中浓度胎盘肽100ul

第三行：低浓度胎盘肽100ul

第四行：最低浓度胎盘肽100ul

第五行：高浓度ConA100ul,终浓度10ug/ml

第六行：中浓度ConA100ul,终浓度5ug/ml

第七行：低浓度ConA100ul,终浓度2.5ug/ml

第八行：完全1640培养液100ul，作为对照

然后培养，加MTT，加DMSO，比色都如常

我的目的在于评价胎盘肽的作用。

实验结果却发现

第一行：高浓度胎盘肽 与 第八行：完全1640培养液 的OD高

其他行OD都低

我的问题是：

1、高浓度ConA可以引起细胞调亡，但为什么低浓度ConA的OD值仍低于对照？

2、免疫调节剂一般大剂量可起抑制作用，小剂量可起促进作用。

若胎盘肽大剂量起促进作用或不起作用，而同时小剂量不起作用（OD和对照的OD相等）我还可理解。

但为何胎盘肽大剂量OD与对照OD持平，而小剂量起抑制作用（OD低于对照的OD）？

丁香园网友Ylcui的建议为：

1、96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高或偏低，原因最简单不过了，温度梯度和水份蒸发的影响。

2、若使用悬浮细胞，建议用酸性SDS溶解细胞，释放甲臢，避免细胞丢失造成的误差。

3、您的空白对照在那里呢？应该做一个呀，MTT试验成本不高，还是尽量加上，使得实验严谨一些。

问题：酶标仪测出的数据总是不稳定,重复性差,希望得到各位的帮助

丁香园网友Ylcui的建议为：

方法本身是很经典的，绝没有问题。请注意如下问题：

加样CV控制在5%以内；

防止细胞丢失；

充分震荡，溶解甲臢；

OD值尽量控制在0.3-0.6之间；

做空白对照

MTT法的关键是必须了解受试细胞MTT结晶还原产物（formazan）吸光值的大小与细胞数量之间的线性关系范围，选择适当的接种密度及细胞培养时间。因此，在进行MTT实验之前，应测受试细胞的贴壁率、倍增时间、不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时细胞不致过满，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。

粉剂用PBS配最好，因为任何有蛋白或酚红的溶液都可影响结果。

下面是我曾经做的MTT，仅供参考：

1、MSC 1×105 ,100ul接种96孔板

2、测前4h，更换无血清培养液，同时加入20ul/孔 MTT液（5 mg/ml），37 0c，5%co2，4h

3、吸取上清，加入150 ul DMSO ，震荡15 min

4、37 0c，5%co2，4h（此时间应根据具体的颜色反映来定）

5、490 nm 测OD 值，

问题：如何计算IC50值？

丁香园网友zoe1996的建议为：

关于这个问题，以前有好多帖子讨论过，建议你看一下以前的帖子

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=96758&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=30#96758

我的方法是用抑制率作为Y，加药浓度的对数作为X，进行线形回归，根据得到的方程求抑制率是50%时的加药浓度，也就是IC50。

我的经验是，因为药物的作用通常是一条S型曲线，在药物浓度很高或很低的时候就接近一个平台，所以加药剂量的选取非常重要，在不知道药物大概的IC50的时候，可以各个剂量之间10倍稀释，这样加药的范围就比较宽，可以摸索到合适的剂量，如果已经有参考的剂量，也可以等倍稀释。如果你得到的抑制率能够分布在50%上下各有几个点，那么以线形回归法得到的结果一般是比较准确的。

不知我说明白了没有？再罗嗦一句，MTT法本身并不是非常准确，一般要重复3次，得到的结果差不多才可信。

丁香园网友Rightye的建议为：

IC50的计算和LD50的计算很相似，可以用SPSS计算。以剂量为横坐标，以抑制率为纵坐标，进行回归分析也可以，但是这有要求：抑制率最好在30-70％之间才能采用回归，因为这一段几乎是直线关系。

问题：DMSO溶解不充分

丁香园网友Goodfreecn的建议为：

我曾作过MTT发现，充分振荡，不到10min，就溶解了；我也见过留较多上清液，再加DMSO，结晶也能充分溶解。我建议，如果你的细胞是贴壁生长的，吸弃上清液后，每孔加入150ul DMSO，振荡10min；如果是悬浮生长的细胞，需离心（1000rpm,5min），然后弃去孔内培养液。

丁香园网友szy20012001的问题为：

求助MTT，脾细胞增殖，OD倒置

我做的是一种动物组织提取物在体外对小鼠脾细胞的促增殖作用，用MTT法

培养结束后加入20MTT继续培养4小时后，发现受试孔颜色明显深于空白对照和阳性对照，空白对照和阳性对照基本还是深黄色。这时我吸弃上清，每孔剩50ul，可以发现空白对照和阳性对照孔底都有紫色点状沉淀，而受试孔底紫色沉淀很少，这样比色得到的OD值收试孔就低于空白对照孔。也就是说加了受试药物使MTT被还原产生的甲赞没有沉淀，而是溶解于溶液中了。

我的受试物主要由多肽和核酸组成，分子量小于3000 谁帮我分析一下原因，提出一些解决方法。

丁香园网友Lzchengfeng的建议为：

MTT的实验我做过很多，根据你的描述。我个人有以下看法供参考：

脾细胞增殖所产生的甲赞颗粒在显微镜下是可见的，比较有特点，一般是青黑色细长晶状，形状象雪花。在其没有被裂解液溶解前，即使是有些颜色，细胞培养液上清应该还是透明的。有时候，一些受试药物会直接干扰MMT的反应，或者药物本身可能会与MTT发生一些反应，这时候，也有可能发现，培养结束后，培养液颜色很深。但是，这些颜色不是MTT还原形成的甲赞颗粒造成的，显微镜下看不到沉淀或者沉淀的形状与甲赞颗粒不同。本人作实验就曾遇到这种现象。这种情况下，解决方法可以从两方面入手：1，试着降低受试药物的浓度；2，在药物与细胞培养结束后，离心后弃去药物上清（贴壁细胞可以直接弃去），然后洗一两次后（最好少洗，以免增加实验误差）。然后再单独加入MMT后培养4H（MTT以无血清培养基配）。

当然，还有一种可能，由于原代分离的脾细胞在体外活力较差，在24h时间里，其代谢使MTT产生的沉淀颗粒比较小，你在吸弃上清的时候，大部分都丢掉了。这种情况我只是猜测，我没有遇到过，因为，我一般是这样操作：加入MMT培养4h结束后，在2000rpm，离心5~10min，然后，用5ml注射器（比用200微升的枪效果好）仔细把上清全部吸弃。在加入DMSO，使沉淀溶解。这样做，基本可以使产生的沉淀都留在孔底。

另外，在用MTT做脾细胞这种体外代谢较慢的细胞，你可以试着提高细胞浓度或延长培养时间的方法，使细胞增殖更充分，这样可以提高甲赞的产量。有利于药物的评价。

丁香园网友lzchengfeng的问题为：

以下是我的实验，请帮忙分析

1、脾细胞悬液刚加入时在孔底分布均匀，培养结束时则聚集成许多小团

2、刀豆蛋白A刺激孔确如你言：甲赞颗粒在显微镜下是青黑色，细长晶状，放射状排列，如雪花

3、我的受试物刺激孔若以完全1640稀释，则高浓度孔显微镜下不见甲赞颗粒，但孔中液体颜色发蓝，OD小于不刺激孔，受试物可能与MTT反应了（我将高浓度受试物直接与MTT混合，37度24小时后MTT发蓝）；低浓度孔显微镜下可见甲赞颗粒，但液体清亮，OD与不刺激孔差不多。 受试物刺激孔若以生理盐水稀释，则高浓度孔显微镜下同样不见甲赞颗粒，但孔中液体颜色清亮，OD小于不刺激孔，为什么？低浓度孔显微镜下可见甲赞颗粒，但液体清亮，OD与不刺激孔差不多。

4、另外，我又对胸腺肽（以生理盐水稀释）做了实验，高浓度胸腺肽孔显微镜下细胞明显多（不见聚集成许多小团，而是布满孔底），显微镜下不见甲赞颗粒，孔中液体颜色清亮，OD小于不刺激孔；低浓度孔显微镜下可见甲赞颗粒，但液体清亮，OD与不刺激孔差不多。

丁香园网友lzchengfeng的观点为：

1、脾细胞悬液刚加入时在孔底分布均匀，培养结束时则聚集成许多小团（这是正常的，聚集成团是细胞克隆增殖的表现，一般情况下，团块的大小和数量可以作为细胞增殖情况的一种标志。当然，要区分死细胞的成团和活细胞的成团的区别。相信你能看得出来。

2、刀豆蛋白A刺激孔确如你言：甲赞颗粒在显微镜下是青黑色，细长晶状，放射状排列，如雪花 ——：）

3、我的受试物刺激孔若以完全1640稀释，则高浓度孔显微镜下不见甲赞颗粒，但孔中液体颜色发蓝，OD小于不刺激孔，受试物可能与MTT反应了（我将高浓度受试物直接与MTT混合，37度24小时后MTT发蓝）；低浓度孔显微镜下可见甲赞颗粒，但液体清亮，OD与不刺激孔差不多。（由此，可以基本断定，你的药物和MMT发生了某些颜色反应） 受试物刺激孔若以生理盐水稀释，则高浓度孔显微镜下同样不见甲赞颗粒，但孔中液体颜色清亮，OD小于不刺激孔，为什么？低浓度孔显微镜下可见甲赞颗粒，但液体清亮，OD与不刺激孔差不多。（不知你此处所指的OD是上清的，还是去上清后沉淀裂解后的OD？。我此处暂按上清中OD推测如下：药物在高浓度下用1640稀释与MTT的直接反应可能牵扯到多种因素：比如1640中的成分，由于1640中的成分很复杂，我以前曾发现过我的药物用1640稀释后直接产生反应（沉淀）的现象（药物溶于水）。在你的实验中，高浓度下形成的颜色可能牵扯到了：药物、培养基、MTT三方面的因素。所以你换了生理盐水就不再产生颜色反应。但是，有一点我不明白，如果你用生理盐水稀释药物，你的细胞能在生理盐水中活24小时？这样“恶劣”的条件肯定影响细胞的活力。如果你仅用NS稀释，后再加到1640的孔中，那么药物还是处在1640的环境中，当然，只是可能1640的浓度低了些。至于高浓度孔为什么没有产生甲赞颗粒，我不敢确定，只能推测有可能你的药物在高浓度下对细胞增殖有抑制作用。 其实，很多刺激剂比如ConA在其浓度超过一定范围时，对脾细胞的增殖反而不如低浓度，甚至有抑制作用。现在有一种理论支持这种现象：活化诱导的凋亡。

4、另外，我又对胸腺肽（以生理盐水稀释）做了实验，高浓度胸腺肽孔显微镜下细胞明显多（不见聚集成许多小团，而是布满孔底），显微镜下不见甲赞颗粒，孔中液体颜色清亮，OD小于不刺激孔；低浓度孔显微镜下可见甲赞颗粒，但液体清亮，OD与不刺激孔差不多。