的。 11、引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的 PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做 Real Time 时，用于 SYBR Green I 法时的一对引物与一般 PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同

开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本次讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。 你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0 ” 。第二步：贴上模板序列。 进入Primer3站点，可以看到一个引物设计

原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 11. 引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 值得一提的是，各种模板的引物设计

于扩增 5~10 个目的片段，原因之一是反应中，每另加入一对引物会导致一定程度的灵活性的丢失。引物数量的增加也使引物二聚体和非特异扩增出现的概率增加。因此，进行多元 PCR 要求周密计划，且需多次尝试，使反应条件优化。 理论上，一个多元反应中，所有引物扩增其特异序列的效率应该是一样的，但通常是很难预测一对引物的效率。在相似条件下，退火温度几乎相同的寡核苷酸可更好地工作。 多元 PCR 引物设计和优化的一般规律 当设计 MPCR 引物时，除了引物设计的一般规律外，其他一些因素也必须考虑