PCR 引物设计小技巧，你 get 了吗？

1、引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计

DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2、引物长度一般在 15-30 碱基之间

引物长度（primer length）常用的是 18-27bp，但不应大于 38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。

3、引物 GC 含量在 40%~60% 之间，Tm 值最好接近 72℃

GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的 Tm 值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50% 寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 5-10℃。

若按公式 Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的Tm为 55-80℃，其 Tm 值最好接近 72℃ 以使复性条件最佳。

4、引物 3' 端要避开密码子的第 3 位

如扩增编码区域，引物 3' 端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5、引物 3' 端不能选择 A，最好选择 T

引物 3' 端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T之间，所以 3' 端最好选择 T。

6、碱基要随机分布

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3’ 端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3' 端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。

7、引物自身及引物之间不应存在互补序列

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免 3' 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续 4个 碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于 4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。

8、引物 5' 端和中间 △G 值应该相对较高，而 3' 端 △G 值较低

△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用 5' 端和中间△G值相对较高，而 3'端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物 3'端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应（不同位置的△G值可以用 Oligo 6软件进行分析）。

9、引物的 5' 端可以修饰，而 3' 端不可修饰

引物的 5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5'端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从 3' 端开始的，不能进行任何修饰。3' 端也不能有形成任何二级结构可能。

10、扩增产物的单链不能形成二级结构

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。

11、引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的 PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

做 Real Time 时，用于 SYBR Green I 法时的一对引物与一般 PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

（1）避免重复碱基，尤其是 G。

（2）Tm=58-60 度。

（3）GC=30-80%。

（4）3' 端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C.

（5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

（6）PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在 80-250bp 之间都可；80-150bp 最为合适（可以延长至 300 bp）。

（7）引物的退火温度要高，一般要在 60 度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。