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类器官培养 50 问-实际操作篇

相关实验:🔥 类器官培养

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Q41: 按照文献方法进行类器官培养,为什么观察到的形态却和文献不一致?

A6: 决定类器官形态的因素有很多:样本来源是否相同、选用的细胞因子品质是否有差异都有可能改变最终的类器官形态。这里举一个文献中的例子,分别取四个高级别浆液性(HGS)卵巢癌患者的肿瘤组织,用同样的条件进行类器官培养,H&E染色结果显示它们的形态千差万别。因此对于类器官的鉴定,我们不能局限于形态观察,需要使用多种方法相结合。

图1. 由 4 例 HGS 卵巢癌患者的肿瘤组织所制备的类器官形态不同1

 

Q42:类器官的药敏实验中需要使用 DMSO 作为药物的溶剂,需要控制 DMSO 的用量吗?

A42:考虑到 DMSO 这类有机物的细胞毒性,建议终浓度不超过 0.1%(v/v)。

 

Q43:培养过程中发现类器官培养物中有黑色小颗粒,这个是杂质吗?应该怎样去除?

A43:黑色小颗粒大概率是杂质或细胞碎片,去除它们有以下两种方式可以参考:

1、将类器官消化下来,用培养基进行反复清洗,达到稀释杂质的作用;

2、用无菌手术刀将类器官切成两半,取 1ml 注射器吸满培养基并轻轻推出,冲洗类器官中的杂质【2】

 

Q44:对于肿瘤患者的个性化医疗测试,PDO、PDX、PDXO 的模型可以相互结合使用吗?

A44:PDO、PDX、PDXO 模型有各自的优势,通常有以下两种结合方式:PDO-PDX 和 PDX-PDXO。

1、PDO-PDX 是性价比更高的方式,即:先利用 PDO 进行高通量的药物筛选,筛选出有效的药物再进行 PDX 测试。

2、PDX-PDXO 是更精准的药物测试方式,即:先利用 PDX 产生大量的体内肿瘤,然后将这些肿瘤分离进行 PDXO 培养,此时可以通过 PDX 模型,将 PDXO 的药敏实验结果与体内用药结果一一对应,进而预测人体用药的结果,实现对患者更精准的用药指导;并且可以用 PDX 模型将转移后的肿瘤分离,同样进行 PDXO 培养和用药,能够更精确地对转移灶进行药物筛选。

 

Q45:类器官怎么从基质胶中回收?

A45:1、将类器官放置在冰上,待基质胶融化后离心进行回收,这种方式适用于不需要将类器官结构完全打散的情况;

2、市售的细胞回收液,可以温和有效地获得细胞悬液,不会损伤细胞或细胞表面蛋白。

 

Q46:为什么用基质胶来培养类器官?可以用其它类型的凝胶替代吗?

A46:基质胶能够为类器官提供支撑作用,目前类器官培养用的基质胶来源于小鼠肉瘤的基底膜基质,其中含有约 60% 层粘连蛋白、30% IV 胶原和 8% 的巢蛋白,还含有基底膜聚糖、TGF-ß、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、组织纤溶酶原等1800 多种独特的蛋白质。由于基质胶中各因子的不确定性,并且存在批次间差异,因此目前也有一些聚焦于基质胶替代方案的研究,如图 2【3】

图 2.基质胶的三种替代方案【3】。(a)去细胞外基质和其他衍生蛋白质,(b)合成水凝胶,以及(c)工程重组蛋白凝胶

 

Q47:怎样确定某一种类器官的培养方式更适用于基质胶包埋法还是气-液交互法呢?

A47:1、根据所模拟的器官自身生长情况选择,例如:皮肤的正常生长是有一面需要接触空气,那么对于皮肤类器官的培养倾向于利用气-液交互法来培养【4】

2、考虑所培养的类器官模型的应用方向,例如:气-液交互法培养易于进行病毒感染实验,因此用于病毒感染实验的气道类器官会优先选择气-液交互法培养【5】

 

Q48:在进行药敏实验前,类器官的接种方式是怎样的呢?

A48:药物筛选前,通常将类器官吹散后,用含 2%-5% 基质胶的培养基悬浮,并最终铺在基质胶包被的孔板中【6-7】

 

Q49:在离心回收时,会有很多类器官粘附在离心管壁,有没有更好的办法提高回收率?

A49:建议采用水平转子代替角转子,可以有效减少类器官挂在离心管壁的情况。

 

Q50:利用肿瘤类器官模型进行筛选的药物有什么局限性吗?

A50:1、抗体药物因为需要免疫细胞的参与,因此肿瘤类器官不能筛选抗体类药物,此类药物筛选需要构建肿瘤类器官-肿瘤微环境的模型来实现;

由于肿瘤类器官中没有对血管进行培养,因此抗血管类的药物也同样不能进行筛选。

 

参考文献

【1】Kopper, O. et al. (2019). An organoid platform for ovarian cancer captures intra-and interpatient heterogeneity. Nature medicine, 25(5), 838-849.

【2】MILLER, Alyssa J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature protocols, 2019, 14.2: 518-540.

【3】Kozlowski, M. T. et al. (2021). Towards organoid culture without Matrigel. Communications biology, 4(1), 1-15.

【4】Gangatirkar, P. et al. (2007). Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nature protocols, 2(1), 178-186.

【5】Mulay, A. et al. (2021). SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. Cell reports, 35(5), 109055.

【6】Van de Wetering, M. et al. (2015). Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell, 161(4), 933-945.

【7】Hirt, C. K. et al. (2022). Drug screening and genome editing in human pancreatic cancer organoids identifies drug-gene interactions and candidates for off-label therapy. Cell genomics, 2(2), 100095.

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6 个回答

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龙大人驾到

有帮助

当按照文献中描述的方法进行类器官培养时,观察到的形态与文献不一致可能有多种原因。以下是一些可能的原因:


实验条件的差异:即使按照文献中的方法进行操作,实验条件的微小差异也可能导致不同的结果。例如,培养基的配方、温度、湿度、气体氛围等条件可能会对类器官的发育和形态产生影响。确保准确地复制文献中描述的实验条件非常重要。


细胞来源的差异:类器官培养可能使用不同来源的起始细胞,如不同的细胞系或组织来源。这些细胞的特性和行为可能会有所差异,导致最终的形态不同。确保使用与文献相同的细胞来源可以减少这种差异。


实验时间的差异:不同的类器官可能需要不同的时间来形成和发育。根据文献中所描述的培养时间进行观察可能是关键。如果观察的时间点与文献中描述的不同,类器官可能尚未完全发育,导致形态上的差异。


实验技术的差异:执行类器官培养的实验技术可能会有所不同,即使操作条件相似。细胞处理、培养器具和观察方法的差异都可能对结果产生影响。确保技术操作的准确性和一致性非常重要。


文献中存在的误差或不完整信息:有时候文献中的方法描述可能存在误差或遗漏,导致难以准确复制实验条件。在这种情况下,可能需要进行实验优化和调整,以获得更符合预期的结果。

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周末也要努力呀

有帮助

如果培养过程中,需要浓度特别低,DMSO浓度高于0.1%怎么办呢

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sswei

有帮助

人工智能全都回答了,不用修改全都正确。

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feixue7758527w

有帮助

写的很全面的,来学习一下,保留备存的。

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高山云初

有帮助

问题都是有答案的,感谢科普与分享

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土井挞克树

有帮助

可以理解为不同位置存在差异,可以多方法进行比较

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