200kd的大蛋白western blot的实验要求是怎样的呢

1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；

2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）；

3）Western转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高！

首先使用6-8%的分离胶，其次电转时间适当延长，250mA，90分钟左右。如果同时需要跑一些分子量小的蛋白，最好将大小两种膜分开转膜

注意以下问题：1、 缓冲液中加甲醇的作用是使SDS游离出来，并增加膜结合蛋白的量，但过多的甲醇会使胶收缩，造成大分子在凝胶中的沉淀而降低转膜效率。大分子量的蛋白质（如大于60kDa）应使用低浓度的甲醇或不使用甲醇。

2、 电转移效果检查方法：①考马斯亮兰染色电转移后的凝胶，检查是否还有蛋白质存留；②丽春红染色，检查膜是否吸附了蛋白质。

3、 湿式电转方法效率高，半干式电转方法转移速度较快。

4、 阻断剂有BSA、Tween-20、脱脂奶粉和其他动物的血清等多种，阻断的效果不尽相同，如果实验中发现背景过高，可以尝试更换阻断剂。

5、 一抗和酶标二抗的浓度十分重要，浓度过高，造成背景过高；浓度过低造成灵敏度偏低，实验中应根据一抗和酶标二抗的效价，对此参数进行优化。此外，一抗的质量十分关键，抗体特异性和效价直接影响实验结果。

6、 须严格控制假阳性反应，可使用免疫前血清作为阴性对照，同时要以抗原作为绝对的阳性对照，准确确定阳性条带的位置。

6%左右的胶，电泳的话得试一下，80V，先跑半小时，然后100V跑半小时，0.45mm 的PVDF膜，转膜普通Western转膜液350MA，90分钟左右

进行200 kDa大蛋白的Western blot实验时，有一些特殊的要求需要注意：

1. SDS-PAGE凝胶制备：由于200 kDa的大蛋白较大，需要使用较低的聚丙烯酰胺（acrylamide）浓度来制备SDS-PAGE凝胶。通常推荐使用8-10%的聚丙烯酰胺浓度。较低的聚丙烯酰胺浓度可以提供较宽的凝胶孔径，以便大蛋白能够迁移和被检测。

2. 蛋白样品的预处理：对于200 kDa大蛋白，通常需要进行较长时间的蛋白样品预处理。这包括将样品在高温（如95°C）下煮沸以解离蛋白复合物，并使用较高浓度的还原剂（如β-巯基乙醇）来断裂蛋白内的二硫键。

3. 蛋白迁移条件的优化：迁移200 kDa大蛋白需要较长的时间和较低的电流。较低的电流可以减少大蛋白的破裂和迁移不均匀性。通常建议使用较低的电流（如30-50 V）并延长迁移时间。

4. 蛋白转移膜的选择：为了适应大蛋白的迁移，应选择具有较大孔径和更高蛋白结合能力的转移膜。推荐使用聚乙烯砜（PVDF）转移膜，因为它具有较高的耐受性和蛋白结合能力。

5. 抗体选择和条件优化：选择适当的抗体来检测200 kDa大蛋白，并优化Western blot的抗体浓度、孵育时间和条件。对于大蛋白，可能需要使用较高浓度的抗体和较长的孵育时间来获得较好的信号。