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跪求:鼠原代血管平滑肌细胞VSMC经验?

相关实验:🔥 原代细胞培养实验

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SCIOK

各位大佬,养过取过鼠的血管平滑肌细胞,能分享点建议,经验,教程,和protocol吗?感谢大家

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2 个回答

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天一湖医者

有帮助

鼠原代血管平滑肌细胞

1)取材:颈椎脱臼处死小鼠,在75%乙醇中浸泡2min,用眼科剪镊依次打开胸、腹腔,暴露心脏;10mL注射器抽取无菌PBS约10mL,连接在1mL注射器针头上穿刺左心室,冲洗主动脉。完整分离主动脉,放入35mm平皿中,加入2mL PBS缓冲液。在体视显微镜下小心将血管周围的结缔组织去除,使用显微弹簧剪沿主动脉纵轴剪开动脉,用显微镊子小心分离动脉中膜层并移入另一个含有2mL含20%FBS的DMFM/F12培养液的35mm平皿中,迅速转移至超净台。用眼科剪将中膜剪成大小约1mm×1mm的组织块,备用。

2)组织块培养法:将组织块连同培养液一起移入6孔板中,小心吸出培养液,摇晃6孔板,使组织块分散分布于6孔板底,将细胞移入5%CO2,37℃饱和湿度培养箱中孵育6h,使组织块牢固贴附于培养孔底部后缓慢加入2mL含20%FBS的DMEM/F12培养液。放入5%CO2,37℃饱和湿度培养箱中培养,每3d换液一次,组织块周围爬出的细胞达到培养面积80%时(18~20d)进行传代。

3)胶原酶消化法:将剪碎的组织块移入到15mL离心管中,加入3mL消化液(7.5mgII型胶原酶溶于5mL含20%FBSDMEM/F12中),放入培养箱中消化6h,1200r/min离心5min,去掉上清,加入2mL含20%FBSDMEM/F12培养基,轻轻吹打分散细胞,接种于6孔板中,置于5%CO2,37℃饱和湿度培养箱内培养,当细胞生长至80%汇合度(7~10d)即可传代。

4)细胞的生长及传代:吸取并弃掉旧培养基,加入PBS磷酸缓冲液清洗细胞充分洗去残留的血清成分;6孔板每孔加入0.25%胰蛋白酶500μL,在37℃消化3min;倒置显微镜下观察到细胞收缩变圆时,立即加入含FBS的培养基终止消化,将细胞从培养板底冲洗下来,以1:3的比例传代至新的6孔板中。每2d换液1次,待细胞生长达到70%以上汇合度时再次传代。

5)小鼠主动脉平滑肌细胞鉴定:分别对2种方法分离的3代和8代细胞进行免疫荧光鉴定。待细胞处于指数生长期时,弃培养基,加入PBS缓冲液清洗3次,每孔加入1mL4%多聚甲醛,室温固定20min;PBS洗3次,加入0.25%TritonX-100室温透膜1h;PBS洗3次,加入含10%山羊血清PBS的封闭液室温封闭1h;PBS洗3次,加入羊抗鼠α-SMA一抗(1:200

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Eason老歌迷

有帮助

嗯啊,整过,丁香实验里没有吗?取大鼠,称重,水合氯醛0。3ml/100g腹腔麻醉。绑好大鼠,先剪开腹腔,剪断腹部大动脉放血,后剪开胸腔,取肺。放入烧杯,后移入超净台,置于冰盒上。以后的操作皆在冰盒上操作。 倒入已加双抗的D-HANKS,清洗肺部,扯掉食管,剪掉心脏。用针头将肺固定在硅胶板上,硅胶板置于培养皿里。用镊子将肺的内外膜除去,只剩下平滑肌。眼科剪将肺部剪成1-2mm的小碎块。将碎块移入配好的消化液中,放入培养箱中,消化15min。取出,加入无血清的DMEM,约10ml,移入离心管中。980转/min,离心10min。 倒掉上清,加入约1ml含20%FBS的DMEm。将碎块用滴管加入25ml的培养瓶里,液体不要加多,有种湿湿的感觉即可。一到两天可以再加点液。

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