跑WB无法跑出满意的条带，怎么办呢？

1. 注意孵育、终止时间

如果想得到漂亮的梯度条带，无论是不同处理时间的样品，还是不同给药浓度的样品，在处理过程中都一定要严格按照设计的时间来孵育和终止，尤其是对于磷酸化蛋白，哪怕 1 秒也不要提前或耽搁。

2. 抑制蛋白降解

这是样品制备中最需要注意的部分。抑制样品蛋白降解的方法主要有两种：

(1) 使用蛋白酶抑制剂

小编使用的是罗氏公司（Roche）的蛋白酶抑制剂 Cocktail 片剂，效果不错。再与 PMSF 共同使用，可以很好地抑制蛋白降解。

(2) 全程低温操作

提前预冷 PBS、裂解液甚至枪头等，从收集细胞开始一直到煮样的全过程都应该尽可能的保持在冰上操作。小编除了使用冰盒，大多数操作都是在 4℃冷房中进行的，虽然有点麻烦和辛苦，但是效果非常好。

3. 裂解液用量

将收集好的细胞加入裂解液进行裂解在操作上是非常简单的，所以这一步的重要性很容易被大家忽视。裂解液的用量直接决定了细胞裂解程度以及裂解后的蛋白浓度。

1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白； 2、转膜 湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。

1) 玻璃要清洗干净；

2) 过硫酸铵和 TEMED 的加量不合适，加量相对较多；

3) 加完试剂后没摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度不合适；

4) 另一个影响胶聚合的重要因素是温度，为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。