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融合蛋白带有SUMO和HIS双标签,挂镍柱后,正常洗杂,酶切buffer平衡三次,加酶,4度过夜酶切,接穿流液,取溢完的beads,跑胶,标签没有切掉,如果是在镍柱上全部洗脱再酶切,标签正常能被切掉,这是为什么呢
百泰派克-李工
这种情况可能由几个因素引起:
1.酶的活性不足:
使用的酶可能活性不高,或者已经失活。酶的活性可以受到多种因素影响,包括储存条件、温度、pH值等。建议检查酶的质量和储存条件,或者尝试使用新鲜的酶。
2.酶的浓度不足:
可能酶的添加量不足,无法充分与蛋白接触或者达到足够的酶切效率。增加酶的浓度可能有助于改善切割效率。
3.不适宜的酶切条件:
酶的切割效率可能受到反应条件的影响,如pH值、盐浓度、温度等。需要优化这些条件以提高酶切效率。
4.缓冲液的选择:
用于洗脱的缓冲液成分也可能影响酶的活性。例如,高浓度的亲和层析柱洗脱剂(如亚甲基蓝)可能抑制某些酶的活性。
如果遇到这种情况,建议分别针对上述可能的原因进行排查和调整。例如,可以通过更换新鲜酶、调整反应条件或改变洗脱策略等方式来尝试解决问题。同时,也可以考虑在体外进行酶切而非在镍柱上进行,以避免柱上可能的干扰因素。