柱上酶切那点事儿
Cytiva（思拓凡）
今天我们就来聊一聊柱上酶切那点事儿~
什么是柱上酶切
柱上酶切纯化路线是指在吸附了标签蛋白的层析柱上添加蛋白酶进行在位去除标签，具有更加灵活、高效、快速的特点。
相比于常规的洗脱后的酶切纯化路线，柱上酶切不仅可以简化酶切后的再次上样操作，同时可以尽量避免操作过程中目标蛋白的损失。
如何进行柱上酶切
柱上酶切纯化路线比较简单，只需上样后加入蛋白酶，在合适的温度下进行孵育一段时间，经过清洗便可得到纯度较高的无标签的目标蛋白。
去除标签的关键在于选择高效的蛋白酶并构建相应的氨基酸识别序列。下表展示的是几种常见的内切酶及对应酶切位点。
组氨酸标签由于分子量小通常不需要去除。如有必要，可使用 TEV 蛋白酶去除组氨酸标签。由于TEV酶带有六组氨酸标签，因此可实现柱上酶切而得到高纯度无标签的目标蛋白。
PreScission Protease 是一种由人鼻病毒 14 型的 3C 蛋白酶和 GST 组成的融合蛋白。它可以特异性的将 pGEX-6P 系列等载体表达出的带有酶底物识别氨基酸序列融合蛋白的 GST 标签进行分离。由于其自身带有 GST 标签，Prescission Protease 能在单一步骤实现 GST 标签的柱上酶切和蛋白质纯化。此蛋白酶在低温条件下具有最佳活性，因此低温孵育不仅可以保证 GST 标签的高效去除，也能维持目标蛋白的活性。
Thrombin 和 Factor Xa 常温下具有较高的酶活，当选择它们进行 GST 标签去除时，可串联一个 HiTrap Benzamidine FF(High Sub) 预装柱，因其可以特异性结合丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和类胰蛋白酶。这样仅用一步就实现酶的去除并获得纯的切割后的目标蛋白。
酶切注意事项
1. 柱上酶切前通常需要进行酶切条件的摸索：可通过一定蛋白样品预酶切以确定最佳反应条件及酶用量。对于不易酶切的蛋白，可通过增加酶量及延长反应时间提高酶切效率。
2. 酶切效率可能会由于一些物质的影响而降低，如在蛋白制备过程中的去垢剂、酶抑制剂或不适合的酶切条件等。
案例分享
以下例子使用 2 个串联的 GSTrap FF 5ml 预装柱纯化 TLP40 蛋白。
- 添加的 PreScission Protease 酶量为 2U/100 µg GST 标签蛋白。
- 根据 GSTrap FF 预装柱大小，用一定体积的 PreScission buffer对PreScission Protease 进行稀释 (如对于 5 ml 预装柱，可用 4.5 ml buffer)。
- 随后以 5-7 ml/min 将酶稀释液注入预装柱中，4℃ 下孵育 12-16h。先洗脱的是酶切后的无标签目标蛋白。
- 再用含 10mM 还原型谷胱甘肽的 buffer 可以将含 GST 标签的所有组分洗脱。
结语
柱上酶切以其灵活快速的特点简化了我们的实验过程。选择合适的内切酶及构建相应的氨基酸识别序列是成功酶切的关键。
Cytiva 提供一个全流程 GST 标签融合蛋白解决方案，包含 pGEX 系列表达载体，GST 标签预装柱及填料，GST 检测试剂盒及一系列位点特异性的蛋白酶。
通常酶切后可以得到非常纯的目标蛋白。如果对纯度仍有更高的要求，也可以结合离子交换或分子筛进行精纯。
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