原理
本方案用DNA点迹杂交检测噬斑以鉴定重组病毒。像点迹杂交一样，将感染细胞裂解物印迹在硝酸纤维素膜上（可参考「痘苗DNA检测实验」中「斑点杂交法」）。用可以识别外源基因表达蛋白的抗体与膜一起孵育，用125I 标记的蛋白 A 检测结合的抗体，还可应用化学发光检测系统，如 Amersham ECL。随后膜在 X 射线胶片下曝光。
材料与仪器
抗外源蛋白抗体 细胞悬液
PBS／Tween（含和不含 BSA）
[125I] 标记的蛋白 A 离心管 离心机 1 ml 注射器的活塞 点迹仪 硝酸纤维素膜 24 孔培养板
PBS／Tween（含和不含 BSA）
[125I] 标记的蛋白 A 离心管 离心机 1 ml 注射器的活塞 点迹仪 硝酸纤维素膜 24 孔培养板
步骤
1. 病毒感染细胞并完成筛选（见「痘苗DNA检测实验」中「PCR 法」步骤 1~9）。
2. 轻轻刮下细胞，转移到离心管中，最大转速离心 30 s，弃培养基，用 200 μl PBS 重悬。24 孔培养板中的细胞也可用 1 ml 的注射器的活塞刮取。
3. 冻融并超声细胞悬液（见「痘苗DNA检测实验」中「PCR 法」步骤 11、12）。
4. 将硝酸纤维素膜剪至适合点迹仪大小，将其用水浸湿，放入仪器中，每孔中加入 20~100 μl 的细胞悬液（步骤 3），用抽吸的方法使液体流过硝酸纤维素膜，随后将膜取出。
5. 用含 4% BSA 的 PBS/Tween 浸润硝酸纤维素膜 30 min，用不含 BSA 的 PBS/ Tween 洗 1 次。
6. 将外源蛋白抗体用最小体积的 PBS/Tween 以 1:50～1:5000 稀释，与膜室温孵育 ≥ 1 h。
7. 用大体积 PBS/Tween 清洗膜 5 次。
8. 用含有 1 μCi/ml [ 125I ] 标记的蛋白 A 的最小体积 PBS/Tween 与硝酸纤维素膜孵育 30 min。此外，化学发光检测系统（如 Amersham ECL）也可检测抗体。
9. 用大体积 PBS/Tween 清洗膜 5 次。
10. 用塑料薄膜将硝酸纤维素膜包好，X 射线胶片放射自显影。
注意事项
1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO2 培养箱中培养，除非有特殊说明。
2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。
3. 除用重组蛋白抗体替换抗痘苗病毒抗体之外，可用「鸡胚成纤维细胞制备实验」、「MVA病毒储液制备实验」介绍的免疫染色法对含有噬斑的感染细胞进行原位染色。
来源：丁香实验
