免疫印迹法-表达蛋白检测实验

当重组病毒通过噬斑纯化和扩增后，免疫印迹可用于鉴定重组蛋白，并检测其是否有预期的大小以及是否从感染细胞中分泌。下面的步骤是介绍检测非分泌性（细胞内）蛋白的，如果重组蛋白是分泌到培养基中的，可按注解中的步骤操作。

生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞 重组痘苗病毒储液
完全 MEM-5 培养基 胰酶 细胞裂解液 5 × SDS 样品缓冲液
6 孔组织培养板 Sorvall 离心机 95℃ 水浴锅

1. 用生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞建立病毒感染细胞培养液（见基本方案 1 步骤 1~5）。

2. 用完全 MEM-5 培养基将 5×10⁵ 细胞/孔放入 6 孔组织培养板培养（每孔终体积为 2 ml）。直至细胞汇片生长（应小于 24 h）。

3. 在使用前，将一定体积的痘苗病毒储液与 0.25 mg/ml 胰酶混合，涡旋混匀。在 37℃ 水浴锅中保温 30 min，并在保温过程中每隔 5~10 min 涡旋混匀一次。

病毒储液的滴度常常在 2×10⁹ pfu/ml 左右，但根据其来源的不同病毒滴度也可能低一些。

如果经过涡旋混匀后，还可以看见团状物，将其冷却到 0℃ 并在冰上超声波作用 30 s。可以重复几次超声，但超声的间隔中应当使样品在冰上冷却。

4. 吸出培养基，加入 1 ml （终体积）MOI 为 10~30 pfu/细胞的完全 MEM-5，培养 1~2 h，每隔大约 30 min 轻轻摇动培养板，使细胞均匀接触病毒。

如果使用纯化的病毒，应在使用前在冰上超声 30 s （见基本方案 1 步骤 7）。

如果分析的蛋白质分泌到培养基中，要注意在感染和培养细胞的培养基中不应添加血清或使用 1% 的血清，因为高浓度的血清会干扰胶的分析。

5. 加入 2 ml 的完全 MEM-5 培养基，培养 24~48 h。

6. 细胞刮刀轻轻刮下细胞，转移到离心管中，5~10℃，1800 g 离心 5 min，弃培养基。

对于分泌性蛋白质，用 Centricon 10 microconcentrator （Amicon） 浓缩培养基，使体积缩小到原来的 1/5。此外，培养基中的蛋白质也可以按下面的方法用三氯乙酸（TCA） 沉淀：

6.1 向样品中加入 Triton X-100 至终浓度为 0.03% （V/V）；

6.2 加入等体积 20% TCA；

6.3 在冰上放置 15 min；

6.4 4℃，以最大转速离心 15 min；

6.5 吸出上清，用 70% 乙醇洗沉淀；

6.6 空气晾干沉淀，加入 5 μl 1 mol/L Tris 碱，溶于 1 × SDS 样品缓冲液。

7. 用 200 μl 细胞裂解液重悬细胞沉淀，将其转移至微量离心管中。涡旋混匀，在冰上放置 10 min。

8. 4℃，最大转速离心 10 min。分离上清（细胞质）和沉淀（细胞核）。

9. 在 20 μl 的上清中加入 5 μl 5 × SDS 上样缓冲液，95℃ 加热 5 min。将沉淀溶于 200 μl 的 1× SDS 样品缓冲液，95℃ 加热 5 min。

10. 按免疫印迹方法进行操作。

1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养，除非有特殊说明。

2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。

3.细胞裂解液只含有非离子型去污剂，可能不能有效地抽提某些蛋白质。在这种情况下，需要含有 SDS 的缓冲液。