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科研学霸天团,48小时有问必答
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请问我这个是什么情况,敷上一抗以后膜上目的条带的位置可以看见灰色条带,但是扫膜看不到目的条带(内参没问题)
whilt-shirt
有可能是二抗的问题,建议重试。
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问
这是我跑的ERK和p-ERK,是要加大蛋白上样量吗,还是减少?
balalaLy
蛋白量没有问题,增加点可能更好。条带有点弥散,可以用好一点的loading
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问
看文献的时候看到了很多免疫共沉淀实验的图,想向各位老师学习一下怎么看这个结果图,谢谢!
balalaLy
图1是用usp26去拉蛋白,flag有条带,说明usp26可以把flag拉下来,即二者有结合,flag是额外加上去连在catenin下游的,usp26实际上是跟catenin结合。图2是反过来用flag去拉可以把usp26拉下来,反向证明usp26与catenin有结合。
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问
组织的ELISA测定
illusio
⼀般按1:9的重量体积⽐,⽐如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加⼊蛋⽩酶抑制剂。
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问
wb样本孔白色条带 marker是黑色的
麻黄连翘赤小豆
看样子是“反影”现象,可能是信号太强,就像是照相的时候曝光过度了,建议提高一抗和二抗的稀释倍数,缩短抗体孵育时间,如果是用ECL化学发光液的话换成低敏的会改善这种现象
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问
目的蛋白表达破碎时用pbs表达在沉淀,换成buffer a蛋白又表达在上清是为什么呢
冷泉港蛋白
1.纠正下 不是蛋白表达在上清还是沉淀,是溶解,我感觉这样说更合适2.你的蛋白应该是疏水性较强,以包涵体的形式存在,简单的说就是形成了多聚体。3.用pbs溶解不了蛋白,因此在沉淀里面;用buffer a,含有变性剂或表面活性剂,破坏了蛋白之间的疏水作用,溶解了部分蛋白出来。
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问
co ip反拉拉不下来
illusio
可能是反拉的抗体不好用,也可能是两者确实有结合,只是反拉蛋白的抗原表位被复合物掩盖,可以尝试使用强度高一点的裂解液,破坏部分的空间构想,再试一次
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问
co ip反向互作做不出来怎么解决
illusio
可能是B的抗体不好用,也可能是两者确实有结合,只是B蛋白的抗原表位被复合物掩盖,可以尝试使用强度高一点的裂解液,破坏部分的空间构想,再试一次
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问
SDS PAGE电泳时,蛋白样本含有高盐成分会对电泳产生什么影响?
申东熙老伯
高盐会对条带有影响,拖尾或者条带两边宽中间空心。如果是盐浓度过高的话,电泳的时候可以先用10V电压跑十五分钟,让样品里的盐分离开,然后再80V跑。
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问
gapdh位置到40了
balalaLy
应该是正常的,36跟40的位置很接近了,而且你的条带很粗,看着就像到40了
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问
弥散性糖基化蛋白纯化后大小变了
illusio
有可能是蛋白降解了,蛋白降解了会出现多带现象,或者蛋白有其他修饰形式比如甲基化、磷酸化
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问
非预染marker如何染色
illusio
考马斯亮蓝染色后不能再转膜,实在想看条带的位置的话,可以将胶上的Marker切下一半先考马斯亮蓝染色,然后根据考马斯亮蓝染色的结果定条带位置,染色后胶的大小虽会变化但变化不大。
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问
WB AKT
麻黄连翘赤小豆
Akt和磷酸化的都有亚型,你要看说明书上的蛋白能显影几个亚型,有个两个有的三个,一般不会只跑出一个条带的
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问
293T细胞养着养着细胞容易变圆变细长,并且生长速变慢怎样解决
麻黄连翘赤小豆
多给一些营养,比如血清看看能不能长挑选适合的培养基加一些生长因子
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问
为什么跑电泳是,每个marker孔的蓝色buffer都有一条竖直的杆?
whilt-shirt
有可能是marker问题,建议更换marker试试
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问
求助:WB的分子变化与理论不符
bamboopiggy
1.你造模不成功,2.你样品处理有问题,3,你的内参选的不对
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问
AML12诱导脂肪变相关问题
Eason老歌迷
你下次提蛋白之前可以观察一下就是细胞,如果都死了,那蛋白也提不出来。
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问
几乎所有的条带都是这样,目的条带上下有很多副条带。以下的条带是什么原因呢?
bamboopiggy
你减少一下二抗的浓度,感觉是你二抗浓度太高了
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问
WB条带很脏,牛奶封闭,洗膜10min×3次,请问怎么解决这个问题?
bamboopiggy
内参都这样子,你有没有考虑你的抗体坏掉了,换新的抗体吧。
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问
请教一下大家有关于蛋白表达的问题
Eason老歌迷
基因说表达,蛋白只能说上调下降
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