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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
蛋白裂解到底多长时间就可以呢?
迟C迟
加RIPA裂解液,4℃摇床上裂解26h和14h即可。
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问
怎样确定最佳缓冲条件和浓度使非特异性结合到羧酸酯化葡聚糖上的靶蛋白和配体蛋白最小化。
dxy_gwrp7ndq
可以进行预实验确定最佳缓冲条件和浓度使非特异性结合到羧酸酯化葡聚糖上的靶蛋白和配体蛋白最小化。
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问
18%分离胶跑酶解蛋白,60mg/ml 上样量10ul,80V浓缩胶120v分离胶跑出条带呈Y型且拖尾严重,求解
dxy_gwrp7ndq
如果蛋白含二硫键的话,还原剂量不足,可能会导致蛋白在跑胶过程中的动态成键,也可能形成拖尾。"拖尾"现象是电泳中最常见的现象。这常常是由于样品溶解不佳引起的,克服的办法是在加样前离心,选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液,加增溶辅助试剂。另一方法是降低凝胶浓度。
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问
请问PI3K-AKT信号通路里的PDK1用WB检测的时候一般测总量,还是测其磷酸化啊?!
府宅
PI3K-AKT通路一般测AKT/PKB信号通路磷酸化蛋白,可以通过检测抗体芯片(PAB216)
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问
敷内参tubulin出现70kd左右的条带是为什么?
dxy_gwrp7ndq
可以用已报道的该蛋白有表达的细胞系做一个对照,最好是抗体说明书上用到的细胞系,这样就可以看看到底是你样品的问题,还是WB体系的问题。
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问
我在跑蛋白的时候,经常遇到泳道一个隔一个有印记,中间的泳道空空如也的情况,检查了转膜液 电泳液 都没有问题,是怎么回事?
bamboopiggy
主要有泳道的影,就不是液体的问题,大概率是你的蛋白坏掉了,建议用新鲜样品。
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问
使用快速封闭的试剂,封闭时间过长会导致一抗孵不上去吗?
bamboopiggy
不会减少封闭时间,只是为了缩短你最实验的时间,封闭时间长了没问题。
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问
跑出来的胶如果能记得加样顺序,那还分正反吗?对转膜应该没有影响吧?
bqejjh123
封闭时使用封闭液,液体盖过膜就好,所以无所谓正反,基本没什么影响
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问
制胶的时候上层浓缩胶制少了,下层多了,但是梳子插得进去,在跑的时候怎么设置参数?
bamboopiggy
可以适当降低电压,由原来的80吧,改为40-60v,跑的慢一些。让蛋白在浓缩胶和分离胶之间能压成一条线就可以。
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问
保存的蛋白质复性,一般使用多少度水浴?到什么程度是复性成功呢?
未来9
样品放入零下20度冰箱中储存,需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样,以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
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问
同样一起跑的条带两边跑的速度不一样是因为什么?
bamboopiggy
大概率是你胶灌的不匀,但是也可能是跑胶槽子里的金属丝坏了,导致电流不匀。
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问
转膜液可以回收吗?能重复利用几次?剩下的能放置多久?
迟C迟
转膜液不需要现配现用,4°保存可以反复使用至少7次, 对WB的结果不起决定性作用. 现配现用,用完倒掉会造成严重的环境污染
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问
蛋白标本保存时加入稳定剂如甘油、白蛋白,会影响之后跑蛋白的结果吗?哪种稳定剂最好?
迟C迟
稳定剂不影响跑蛋白结果,一般保存的时候会加入甘油。
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问
用比色皿还是微孔法好呢?总体算下来,哪个更节约经费啊?
bamboopiggy
微孔法啊,上样量少,省时间。还不用洗皿。
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问
使用超声破碎还是钢珠会更适合?
dxy_gwrp7ndq
超声波破碎很强烈,适用于多数微生物的破碎,但有效能利用率低,破碎过程产生大量的热,且对冷却的要求相当苛刻,故不易放大,主要用于实验室规模的细胞破碎。
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问
配置的蛋白标准液是现配好,还是提前配好−80度冻上?
迟C迟
那得看用什么检测了双缩脲法需要现配置水合茚三酮可以使用提前配置好的溶液
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问
WB扫出来的图第一次有气泡,再扫一遍会有影响吗?
Lyy娟娟lxj
没影响,静置一会儿能用。就是配胶的液体全部在四度存放,室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系,液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡,这种情况在夏天室温较高时更容易出现。
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问
在点样的时候先加样品还是先加显色剂?需要考虑反应起始时间相同的问题吗?
dxy_gwrp7ndq
当然是要先稀释样品,再加显色剂,否则一会造成显色剂的稀释,有误差,
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问
请问一下,SDS-PAGE蛋白质电泳,最近跑出来的胶都是这样的,以前不会,更换了配胶的母液,Buffer,还是一样,有哪位大神知
Lyy娟娟lxj
胶的凝结不好,例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下,在分离胶的下部有波浪样的花纹,凝胶不均匀。解决方法:加大TEMED和过硫酸胺的量,使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板,防止有残留的胶干结在玻璃板上。胶不凝,解决方法:温度较低时加大TEMED和过硫酸胺的量,过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。胶易碎,例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。解决方法:首先
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问
一张膜曝光之后,用那种膜洗脱液效果比较好,洗多久合适?
府宅
TBS/T洗膜3次,每次5分钟。用滤纸去尽残液
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