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科研学霸天团，48小时有问必答

问尿素处理包涵体蛋白

loveliufudan

对于包涵体中的蛋白质，通常需要用尿素进行处理以帮助其在电泳过程中展开成线性构象，从而更容易被分离和检测。下面是一般的尿素处理协议，供参考：材料：包涵体样品蛋白质电泳缓冲液（含有适量的尿素）1 M Tris-HCl pH 8.01 M DTT1 M IAA（碘乙酸）蒸馏水步骤：在室温下取出包涵体样品，加入足量的蛋白质电泳缓冲液，并混合均匀。将样品加入1 M DTT（终浓度一般为10 mM），使其还原

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问【WB求助】蛋白跑到一半下不来

loveliufudan

可能存在以下几个问题及对应的解决办法：1.蛋白质条带卡在某一个水平，无法继续迁移：这可能是由于电泳缓冲液的pH值过高或过低导致的。您可以尝试调整pH值到6.8-7.8之间，看看是否有所改善。此外，电泳温度过高也可能导致此问题，您可以降低电流或将电泳槽放在冰上进行电泳以降低温度。2.蛋白质条带分离不良：这可能是由于电泳缓冲液中离子浓度过高或者不均匀导致的。您可以尝试调整离子浓度或者尝试新鲜制备电泳缓

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问BMDM消化 M2与T共培养

loveliufudan

如果您想消化MO并重新铺板做M2极化，可以将MO收获后通过特定方法消化，比如使用0.05%胰蛋白酶-EDTA等试剂进行消化。消化时间可以根据实验需要和所用试剂进行优化。通常，消化时间在10-30分钟之间，可以通过观察细胞状态来决定是否需要延长或缩短消化时间。消化后重新铺板并进行M2极化，可以使用一些常规的方法，如IL-4和IL-13等促进M2极化的因子。此外，与T细胞的共培养也是可能的，但是需要具

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问请问如何提取耳蜗基因组？

loveliufudan

1.收集样本首先需要收集耳蜗样本。可以使用小鼠、人类或其他动物的耳蜗组织，根据实验需要选择。2.细胞裂解将收集的样本置于液氮中，然后用组织破碎机或手工研磨器将样本细碎。加入1x PBS液体，彻底混合，最好放到冰上搅拌15-30分钟，以细胞裂解液裂解细胞膜并释放DNA。这里建议加入蛋白酶抑制剂，以防止DNA降解。3.提取DNA加入适量的DNA提取试剂（如膜分离试剂、异硫氰酸盐、酚/氯仿等），并进行高

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问细胞培养出现了许多细胞碎片该怎么办？如何避免？

橙汁儿青柠味

可以通过pbs多洗涤，消化离心去上清等从而去除细胞碎片，主要注意控制胰酶消化时间，防止过度吹打细胞

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问氰基柱在反向系统时有什么注意事项

细水长流NAPI

1.避免中等极性溶剂，不可保存在这类溶剂中2.流动性平衡要足够时长3.氰基柱相切换使用下，要充分过渡

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问细胞培养液中蛋白富集方法

loveliufudan

分泌型蛋白的富集和沉淀方法有很多种，具体选择要根据您的实验需求和目标蛋白的特性来确定。以下是一种通用的筛选和富集分泌型蛋白的方法，供您参考：收集细胞培养液：当细胞生长至合适的密度时，收集培养液。您可能需要在收集前移除浮游细胞或细胞碎片。为此，可以将培养液通过低速离心（例如1,000-2,000 xg，10分钟）来实现。培养液的过滤：为了去除残留的细胞和细胞碎片，可以将收集的培养液通过0.22或0.

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问cutoff值是否与限制性立方样条中HR＝1的点等同?

毛利小五郎的徒弟

不是同一个，cutoff更倾向于比较特异性和敏感度。

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问wb中电泳上样时loading buffer和sample buffer 的区别

asswei

samplebuffer指的是双向电泳样品缓冲液，样品的特征：复杂，含盐或其他污染物，易被蛋白酶降解，动态范围宽（>X106），溶解性不均一（疏水性/亲水性），分子量、等电点的范围宽（10-500KDa，pH2-14）。loaderbuffer指的是上样缓冲液，也就是样品中加的缓冲液，是一种用于DNA电泳试验的缓冲液。因此两者不一样。

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问盐浓度、pH对BCA蛋白浓度检测影响大么

asswei

根据BCA法原理，将copper（Ⅱ）离子还原为copper（Ⅰ）离子需要正确的pH值。同时，样品的pH值也会影响反应的效率。

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问UBA6可以作为FAT10的底物吗？

asswei

UBA6与FAT10能形成异肽键，可以与FAT10会形成类似泛素的链。

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问蛋白表达咨询

loveliufudan

可能的原因有很多。可能是DNA转化效率不稳定，或者蛋白表达和折叠过程中存在问题，也可能是您的操作问题。以下是一些可能的原因和解决方案：1.转化效率不稳定：在您的实验中，37摄氏度生长可能会影响BL21(DE3)的转化效率。转化后，应该在室温下快速混合细胞和LB培养基，恢复期一般为1-2小时。然后将细胞在LB/ampicillin板上培养过夜。您可以考虑增加培养时间，以获得更好的转化效率。2.蛋白表

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问WB转膜部分失败，一个夹子里的有的就成功了，有的就失败了，求各位大佬指点

balalaLy

一个夹子尽量只转一张长8cm，宽4cm的膜，太大的话边缘容易转不上，另外转膜的时候尽量不要把胶裁开，夹夹子的时候容易使膜移位。

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问琼脂糖凝胶电泳

橙汁儿青柠味

主要是引物设计的不够特异，所以pcr出来很多非特异性的条带。可以在设计好引物后，在ncbi上面blast验证一下

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问请问怎么从细胞培养基中提取分泌蛋白呢？

橙汁儿青柠味

分泌蛋白存在于培养基中，首先可以减少培养基，从而增加蛋白浓度，如果蛋白量还是不够，可以将蛋白用真空干燥机进行浓缩冻干，然后再进行适当溶解即可。

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问我想请问一下如何寻找某一种糖基化修饰相关的糖基因或者酶基因呢？我前期通过实验发现某个抗体阳性的患者中，其贝塔-N-乙酰氨基葡糖胺

loveliufudan

2 回答44 围观

问为什么？小鼠皮肤组织蛋白

橙汁儿青柠味

首先确定蛋白浓度以及上样量足够，其次确定抗体种属正确。

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问成骨诱导救救孩子吧

loveliufudan

没有染色前的钙化结节可能难以观察到，因为钙化通常是细胞死亡或坏死的结果，会在钙离子等离子体中沉积形成。在组织切片或细胞培养中，未染色的钙化结节通常呈现为无色或白色颗粒或斑点，大小和形状不一。如果您在组织切片或细胞培养中观察到了这些颗粒或斑点，可以结合组织形态学和细胞学特征，如细胞形态、细胞核大小和形态等，来判断它们是钙化结节还是其他类型的结构，如死细胞团块。同时，钙化结节通常需要通过特殊的染色方法

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问【求助】ELISA检测STC-1细胞上清中激素实验问题

loveliufudan

ELISA检测吸光度过低可能有多种原因，其中包括蛋白质降解、稀释过高、实验操作不当等。考虑到您检测的是细胞上清中GLP-1、CCK、PYY等蛋白质，蛋白质降解可能是一个可能的原因。如果您怀疑蛋白质降解可能影响ELISA检测结果，可以考虑加入蛋白酶抑制剂来保护蛋白质。蛋白酶抑制剂可以避免蛋白质在细胞上清中被降解，提高样品中蛋白质的浓度和稳定性。另外，您也可以考虑调整实验条件，如缩短采样时间、降低稀释

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问关于IFN-γ和TNF-α诱导特应性皮炎炎症细胞模型的问题。

毛利小五郎的徒弟

加入这两种物质是诱导凋亡的，所以你后续的浓度摸索是对的，可以采用后面的浓度梯度进行实验。

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