丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册

WB结果分子量增加了20kDa,怎么去磷酸化、去糖基化来验证翻译后的修饰

user-title

Xdoc

wx-share
分享

1 个回答

user-title

百泰派克-李工

有帮助

Western Blot(WB)实验中,若观察到某蛋白的分子量相比预期增加了20kDa,这可能表明该蛋白经历了翻译后修饰。为了验证这一点,你可以采取以下步骤:

一、去磷酸化验证

1.样品准备:

首先,确保你有足够的蛋白样品。

2.选择适当的磷酸酶:

通常使用碱性磷酸酶(如Lambdaprotein phosphatase)或其它专门的去磷酸化酶。

3.进行磷酸酶处理:

根据酶的说明书进行操作,通常是在特定的缓冲液中和酶一起孵育样品一段时间。

4.再次进行Western Blot:

处理后的样品再次进行WB分析。如果蛋白的分子量减少,接近其预期大小,这表明蛋白质可能经历了磷酸化修饰。

二、去糖基化验证

1.样品准备:

同样,确保有足够的蛋白样品。

2.选择去糖基化酶:

常用的去糖基化酶包括PNGase F、O-糖酸酶等,这些酶可以去除N-或O-连结的糖链。

3.进行去糖基化处理:

根据酶的说明书进行操作,通常需要在特定缓冲液中孵育样品和酶。

4.再次进行Western Blot:

处理后的样品进行WB分析。如果蛋白质分子量减少,接近其理论大小,这可能表明蛋白质经历了糖基化修饰。

在进行这些实验时,重要的是要对照实验组(未处理的样品)和阴性对照组进行比较,以确保实验结果的准确性。此外,优化实验条件对于获得可靠的结果至关重要。


提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序