实验问答4,314,197 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问同一个蛋白（带his-tag），分别用his和其特异性抗体去免疫，WB结果，his的正常，另外一个什么也没有（同一个人同时进行）

dxywode

WB或者anti-his的抗体检查His是否表达；从上游构建入手，改变His-tag的位置（C-terminal or N-terminal），必要时增加His个数（常用6-10个）

3 回答86 围观

问western提取出来的蛋白质保存方法？

府宅

蛋白样品放到-80℃也并不完全保险，虽然能存放久一些，但是最好不要冻融超过两次。蛋白浓度测定后，可以加入loading buffer 煮样，煮后可根据实验需要分装成小管，下次实验前拿出小管再次煮样即可。

6 回答466 围观

问提高电泳分辨率的途径有哪些？

bqejjh123

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高电泳的分辨率。

4 回答322 围观

问westernblot加样的顺序是什么？

dxy_gwrp7ndq

上样顺序一般是让与抗体有反应的样品和没有反应的样品间隔开，这样条带之间反差比较明显。

4 回答142 围观

问蛋白质变性的温度点是多少度？

府宅

蛋白质一般都是在100℃沸水浴加热5-10分钟，以达到变性的目的。

4 回答1474 围观

问WB中内参的意义是什么？

dxy_gwrp7ndq

1. 是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候，内参照蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题，是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。2. 是比较客观的说明目的蛋白的表达情况，消除上样量等的误差。不同的标本之间由于蛋白提取的量有差别，可能强阳性的表达跑出来的带很弱。因此设立内参照，比较不同标本之间的表达情况。

3 回答5531 围观

问引物设计特异性好，但跑胶有隐约杂带是为什么呢

府宅

1.外源DNA污染，确保操作的洁净；2.Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度；3.若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。

4 回答163 围观

问WB中BCA法标准曲线怎么做？

邓豆豆逗

找一个已知准确浓度的蛋白（一般试剂盒的话里面是有的），自己也可以用bsa配，然后稀释一个浓度梯度，比如2，1.5，1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1，0ug/ul，然后每个样至少三个复孔，做出来的od值和浓度做一个散点图，添加趋势线得到公式，然后再将样本的od值带入公式求得浓度就行了

3 回答296 围观

问跑western blot的时候同一个抗体同一个细胞系或者组织，出现条带数不一致的原因

dxywode

条带位置异常可能是蛋白出现聚体或被修饰，蛋白出现降解有关。

3 回答359 围观

问如何选择凝胶，以及层析柱？

bqejjh123

层析柱的选择一般根据分离样品的种类而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的 25～100 倍；而除盐或除游离荧光素时，柱床体积约为样品体积的 4～10 倍。层析柱太短会影响分离效果，如太长会延长分离时间和过度稀释样品。层析柱的内径过细会发生「器壁效应」。层析柱的内径和高度有一定的比例，除盐柱应为 1:5～1:25，纯化蛋白质柱应为 1:20～1:100。

4 回答638 围观

问骨组织wb内参不齐怎么整？

dxy_gwrp7ndq

不齐可以进行定量分析，然后用目的蛋白除以内参。定量用image plus6

4 回答103 围观

问wb怎么根据内参调整上样量

whilt-shirt

先用Image J计算内参的灰度值，然后选择其中一个样本作为参照，用这个参照样本的灰度值除以其他各组样本的灰度值再乘以各组上样量，就得到最终各自的上样量

3 回答3408 围观

问样品体积增加后，对蛋白质的纯化效率有怎样的影响？

迟C迟

样品体积增加，是提取的样品量增加了吗？建议裂解液同步增加，裂解时间也需要延长，不然会影响蛋白纯化效率。

3 回答371 围观

问免疫组化时染色比较弱拍图不好看怎么调整？

dxywode

小心处理组织样本，尽量保持组织细胞结构的完整性。如果组织的穿透力差，则要制备较薄的切片。调整好固定液的理想pH、固定时间和温度。可考虑用单抗（不是多抗），避免交叉反应。如果非特异性结合太强，则适当减少抗体的孵育时间。

3 回答147 围观

问做WB曝光后目的蛋白位置出现2个相邻条带，但是抗体说明书上没有提过会有2条带情况，原因可能是什么呢？

邓豆豆逗

可以先看一下抗体官网的一些效果图，是否做出来有两条带的现象，其次查一下相关文献，看这个蛋白是否有剪切体或一些修饰之类的，还有可能是蛋白降解了，这时候可以找一个阳性对照一起做，如果阳性对照是单条带，就考虑是样本的原因了

6 回答69 围观

问怎样提高WB实验蛋白定量与上样量的效率及准确性？

bamboopiggy

这个，只能说勤能补拙，多做，经验丰富了就好了。一般情况下，在做标曲的时候，加样要准确，标曲出来的R^2值，接近0.99最好。样品稀释时，枪尖要和枪match，吸液时，枪尖别下的太深。上样时，同样注意枪尖和枪的match程度，以及枪的准确性。

4 回答133 围观

问蛋白质的等电点是否与蛋白质的质量有关？

天一湖医者

蛋白质是两性电解质，其等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关。各种蛋白质因氨基酸残基组成不同，等电点也不一样。

5 回答173 围观

问蛋白纯化常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象，怎么解决？

桐轩456

首先我们要知道包涵体形成是因为外源性重组蛋白在高表达时，由于蛋白折叠辅助因子不足，在蛋白折叠之前分子间连接的疏水表面暴露在外面，导致折叠中间体大量堆积，并且这些中间体对蛋白酶的降解有抑制作用；对于大量折叠错误蛋白的出现，重组细菌体内缺乏相应的反应机制来恢复蛋白的正确折叠；促进细胞表达的蛋白多肽的溶解和正确折叠功能的丧失；蛋白或多肽自身结构在热力学和动力学上失衡；一些环境因素(如高温、酸性介质)能明

4 回答229 围观

问蛋白诱导时间如何确定？IPTG大家都用什么浓度？

bamboopiggy

IPTG配制成24 mg/ml（100 mM）蛋白诱导时间，你要做预实验，因为取决于你的菌，温度，还有转速。可以梯度做一下看看，一般BL21DE3，37度，12-16个小时，200-250rpm，就可以，但是有的要降低温度，和速度，延长时间。

4 回答9383 围观

问怎样提高蛋白质在醋酸中的稳定性？

天一湖医者

1、尽量在相对密封和无菌的环境下快速进行分离操作2、在生理温度和压力范围内完成分离纯化操3、慎用溶剂和酸、碱、盐类，使用前要进行详细的试验，确定最佳添加量和条件;4、钝化或抑制蛋白质分解酶类的活性;5、选择合适分离方法。如:凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析、电泳、结晶等。

4 回答114 围观

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