实验问答4,312,803 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问反转录试剂盒放于室温一天

bamboopiggy

不建议用了，但是你如果不舍得，可以先做个预实验试试，测一个关键基因，加一个内参基因。

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问H9C2心肌细胞提RNA做QPCR内参选择

illusio

β-actin作为mRNA检测内参基因的范围比较广泛(除心肌，骨骼肌，平滑肌，特定肿瘤和组织之外)；广泛用做western内参；GAPDH由于受代谢及影响因素较多，一般不用mRNA检测内参，广泛用做western内参。有文献H9C2心肌细胞用以β‑tubulin为内参。可以多去看一下文献

3 回答150 围观

问RT-PCR实验内参问题

illusio

可能第一遍的时候RNA降解严重，或者逆转录失败

3 回答147 围观

问qPCR熔解曲线乱，有主峰，但有杂峰，80°C以下90°C以上都有，为什么

爱吃水稻的小呆瓜

建议定量引物先跑一趟琼脂糖电泳看一下条带，如果条带单一明亮，再去跑定量。如果还有很多峰，可能是引物二聚体，建议更换引物试试

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问移液器加样问题，怎么样比较准确

bamboopiggy

其实都可以，就是你要给自己养成一个习惯，类似的操作，都要用类似的方法，如果你210 都用1ml的枪加，或者是105加两次，都可以，看你习惯。但是不建议换枪加

3 回答116 围观

问用trizol提取小鼠组织rna，加入trizol匀浆之后trizol变成红褐色加入氯仿离心得到上清液是黄色的是怎么回事

bamboopiggy

你提取的是肝组织吧？量太大了，没裂充分，最好减少肝组织的体积。

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问pcr实验加样走位问题

麻黄连翘赤小豆

加样看你怎么安排的样本，有几个样本，准备多少复孔合适，没有固定的走位，横着竖着都行，加准就行

4 回答117 围观

问PCR八连管可以用记号笔做记号吗

麻黄连翘赤小豆

八连管本来就有标记，避免荧光问题，你可以拍照，或者画图在记录本上进行标记

6 回答192 围观

问用trizol提组织rna，匀浆后trizol变成红褐色，并且离心之后没出现上层清液是怎么回事

whilt-shirt

trizol加完后要加氯仿振荡后离心才会有上层清液

3 回答75 围观

问qPCR空白对照水和阴性对照都P出来了，换了机器也还是P出来了，为什么？

dxy_v7pcsvp5

体系有污染，或者实验样本浓度太高，加样手法有问题，枪头在pcr管子上面开会晃，污染了其他孔位

5 回答125 围观

问qPCR熔解曲线都是乱的，荧光信号强度也不高，9个孔4个过不了阈值没Ct，为什么？

Eason老歌迷

可能是反应体系污染，结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。也可能是试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。或者是仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养可能是。耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。

4 回答115 围观

问LPS诱导细胞炎症相关信号通路

bamboopiggy

lps诱导炎症，就必然和一些经典的通路有关系。至于抑制剂，有得公司有mapk抑制剂得library，或者你可以看看FHPI，或TAK-715，都是p38的抑制剂

3 回答219 围观

问qpcr同一样本的三个复孔，A产品八联管做重复性很好，B产品重复性很差，但是师姐用B产品做重复性没有问题，那问题出在了哪

whilt-shirt

有可能是人为操作的差异，建议多次重复

3 回答106 围观

问设计引物中16s是什么？该怎么找

Eason老歌迷

16SrRNA即16SribosomalRNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。16S中的"S是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有原核微生物的基因组中。16SrRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。

3 回答110 围观

问关于PCR，德塔CT值的问题，采用ARMS-PCR法但按照说明书需要判读德塔CT，这个德塔CT值的意义是什么呢

Eason老歌迷

我们都是用2的负ΔΔct值次幂来判断qpcr的结果，不用Δct值，Δct值是目的基因组减去内参组。

1 回答145 围观

问关于PCR曲线起始不平滑

凌晨三点的大峃

1.自动基线问题2.反应体系上机前混匀3.八连管盖盖紧，防止体系蒸发导致基线抬升

4 回答133 围观

问求助引物设计实验中要找细菌的特征性序列的步骤

Topmicro

你所说的细菌特征性序列是指特定种属还是特定菌株？特定种属的话可以直接找论文看大家用的比较多的。特定菌株的得需要全基因组测序你自己比对查找了。

2 回答159 围观

问PCR的扩增曲线坑坑洼洼像房颤了

凌晨三点的大峃

1.仪器电压电流是否稳定2.卤素灯是否老化没校准3.八连管质量怎么样，之前用有没有出现问题？这种情况是每次都出现，还是偶尔出现？4.往信号不稳的方面思考下

6 回答146 围观

问关于PCR分子检测的内标问题

Eason老歌迷

因为新冠肺炎疫情原因，核酸检测频次骤升，而核酸检测本来就是pcr的一种，这也带动了我国pcr的规范化操作的进展。我国有相关机构有建议在PCR分子检测项目中需要内标用于监测的文件，具体文件请移步于相关国家官网查看。对于全血和口腔粘膜做基因检测没有相关文献或资料不建议使用口腔粘膜来做。

1 回答104 围观

问做PCR时只加一种引物，琼脂糖凝胶电泳可以跑出来条带吗

huang282815

加一种引物一般是没有条带的，一般是加一对引物

4 回答75 围观

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