想问一下懂行的大佬，最近在用crisper cas9做基因的片段敲除，敲的是一株产油酵母里的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因。

敲除效率受多方面因素影响，建议从以下几点考虑：

1.基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内。

2.不同 靶点在基因敲除效率上有较大差异，因此同时设计构建 2～3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。

3.N1-N20NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 7～12 个碱基的错配对 Cas9 切割效率影响较小。设计好的靶点序列应在基因库中进行 BLAST 检测。

4.需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距 20～30bp 的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因敲掉之后，菌只能无氧酵解

1.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）是参与糖代谢途径中的一个重要酶，在酵母中起到催化葡萄糖-6-磷酸向糖醛酸转化的作用。如果敲除了G6PDH基因，可能会影响酵母对葡萄糖的利用能力，因为这是葡萄糖代谢途径的关键酶。但是，酵母可能会通过其他代谢途径来利用葡萄糖或者利用其他碳源，所以需要具体实验来检测是否会影响葡萄糖的利用。

2.CRISPR/Cas9技术敲除效率受到多个因素的影响，例如sgRNA的设计、sCas9的浓度和细胞状态等。以下是一些可能有用的方法来提高敲除效率：

sgRNA设计：在选择sgRNA时，需要考虑其在目标DNA上的位置、长度、互补性和靶位点的特异性。理想的sgRNA应该具有高特异性、较高的敲除效率和较低的假阳性率。还可以考虑使用CRISPR-Cas9在线设计工具，如crispr.mit.edu和zlab.bio/crispr等。

双sgRNA策略：双sgRNA敲除策略可以提高敲除效率和特异性，因为两个sgRNA同时作用于目标位点，使其成为一个切口。但是，两个sgRNA之间的距离应该适当，太近或太远都可能降低敲除效率。

优化Cas9蛋白浓度：Cas9蛋白的浓度也可能影响敲除效率。过高或过低的浓度都可能降低敲除效率。因此，应该通过实验来确定最佳的浓度范围。

细胞状态：在进行CRISPR/Cas9基因编辑之前，需要确保细胞处于合适的生长状态，例如处于对CRISPR/Cas9基因编辑敏感的生长期。

其他策略：还可以考虑使用化学剂或光刺激等方法，如使用Cas9和化学剂联合处理，或利用光敏Cas9和脉冲激光等光源来提高敲除效率。