【交流】总结一下最近做大片段克隆的心得

总结一下最近构建质粒的心得，最近构建这个质粒已经有2个月了，一直没成功，到最近才有点眉目，只等测序了。其实质粒构建很容易，但有时候就是得不到结果，对于大片段（》3kb）要克隆到载体里，还是有难度的。

首先介绍一下背景，我的质粒是pcDNA3.1+,片段是4371bp，刚开始我是用cDNA跑PCR，用的是高保真的酶，PCR产物也很完美，浓度也不低，用的是NotI单酶切，然后把质粒去磷酸化后再做连接。

在百度上搜索到有人介绍说保证片段与质粒比15：1，所以我在用普通的比例10：1-3：1没有成功后就改成这个比例，结果也是不成功，要么就是原质粒，要么就是乱七八糟的条带，要么就没有条带，然后我又重新设计了引物。

引入EcoRI和NotI位点，同时我也留心做了对照（以前从未遇到过这种问题，克隆这么简单的事情根本都没用过空白对照的），刚开始用双酶切系统，切完后胶回收，结果空白对照（连接体系中不加片段，只加双酶切质粒）长出的菌落远高于重组连接组。

按分子克隆上介绍应该是后者比前者10：1,而且我还发现，加入的片段与载体摩尔比越大，结果长出的菌落越少（不知道该怎么解释？）我以为是酶切不完全，然后我就使用单酶切，按顺序切，先切EcoRI和NotI都做过，结果还是同上，无解。

后来我在丁香园上求助，有位兄弟指点说PCR产物克隆这么大片段有难度，建议我使用直接酶切获得这个片段再做（因为我刚好还有另一个测序正确的pshuttle-CMV的重组质粒），而且要求我保证质粒质量，最好是大抽，于是我又回到开始。

先大提p-CMV和pcDNA3.1+,然后做NotI酶切，刚开始酶切体系都用50ul，质粒用量4ug，结果就是跑胶时片段与质粒分不开，分析是质粒用的太多了，后来我改进方法，用1ug质粒，多切几个管，最后合并回收，这样可以保证质粒用量，因为下一步还要去磷酸化，质粒损失不少。

于是这样做了一次，涂板的时候把感受态全涂板，结果杂菌很多，后来摸索到转化的时候加400ulLB至感受态摇45min后取150-200ul涂板最合适，杂菌会大大减少，还有就是保证涂板后平板干燥，或者是先正面放平板吸收液体后再反过来。

这样杂菌会少很多（杂菌是影响挑菌的重要因素，因为最后挑的是小菌落，这是针对大片段DNA克隆而言的），这样做了下发现终于有一个重组子了，遗憾的是不是正向连接的，是反向连接的。

这里面有个关键，凡是大的菌落都是pcDNA3.1+质粒，因为这个质粒长的很快，小菌落有的是杂菌，部分是重组子，而且最好是等平板长到16-18小时的时候挑菌最合适，摇菌的时候也是，如果在5-6个小时就已经浑浊的话，这个菌就不是重组子。

潜在的大片段重组子一般要在摇菌12小时以后才开始变浑浊，生长缓慢，摇17-18小时合适（不过也有个别现象，不绝对），摇出来的菌最好不要收藏，要立即抽质粒，我利用这个办法抽了10个质粒，有5个是重组子，但其中4个是反向的插入片段，但好歹也有一个是正向插入的，希望这些经验对同仁有用。

片段与质粒连接比例用5：1合适，一般质粒用30ng左右就可以了，连接体系用10ul或15ul，挑菌挑只有最大菌落的1/4大小的饱满的菌落，摇菌17小时最合适，保证质粒质和量，最好大提后再做，毕竟国内的回收纯化试剂盒的效率还是比较低的，连接前一定要测浓度，即可了解DNA的质量，又可以为连接提供准确的量。