为什么在做qpcr时会出现bar值过大？所有孔同样方法加入，会有一两个孔无数值出来？

1.加样不准确。2.试剂室温存放时间过长或加样过程误差！3，系统错误

有可能是加样时没有完全打掉，这种基本上属于加样误差

原因可能有:① 移液枪不准，加样不准确。更换性能更好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中② 定量PCR仪在不同位置温度不一样。定期校准定量PCR仪③ qPCR预混液未混合均匀。使用前应充分混匀qPCR预混液

首先要确定移液器是否准确，加样量是不是一致的，如果严格保证前两项，那在上机前离心了么，确保样品在管底均匀分布。最后机器没问题吧

只能说可能是样品没有混匀。枪头和枪不match，您没加进去，机器的孔被污染，都是可能的

荧光定量PCR会加入带有荧光基团的探针，探针是能和目的基因结合的单链DNA，如果合成双链DNA后，荧光基团就会激活发光，所以实时检测反应物的荧光强度，反应的就是双链DNA的浓度，由于合成双链DNA的速率和模板浓度有关，所以和参考曲线比较以后是可以计算出模板的相对浓度，当模板是信号RNA是，其反应的就是基因发达的量。

可能是以下原因导致:模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物，扩增产物长度最好不超过300bp。体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

我们实验室也会遇到同样的情况，如果每一板都是同样几个位置的孔数值无法读出，是qPCR仪使用久了，需要工程师来调试一下。

如果每次读不出来的孔位置不固定，那就是操作有误，96孔板放入仪器之前是否离心一下，反应体系是否混合均匀等等。

无 Ct 值出现

　　检测荧光信号的步骤有误：一般 SG 法采用 72℃ 延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

　　引物或探针降解：可通过 PAGE 电泳检测其完整性。

　　模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

　　模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

如果是SYBR Green MIX的话，检查你的溶解曲线。如果溶解曲线都没有，就是模版或者引物没有加进去。