没有 CT 值，我的 QPCR 实验失败了吗？（下）

在上一篇文章《没有 CT 值，我的 QPCR 实验失败了吗？（上）》中，小编给大家讲述了 CT 值是什么，它是如何产生的，并分析了一些没有扩增曲线导致无法计算 CT 值的案例。但除此之外，有的时候也会出现有扩增曲线，但没有 CT 值的情况。我们今天的这篇文章就继续分析有扩增曲线，但没有 CT 值的一些案例。

情况三：有扩增曲线

有扩增曲线的情况也可以分为两类：有正常的扩增曲线和异常的扩增曲线。

案例 5：

有时候我们会发现明明扩增曲线是正常的，但却没有 CT 值。比如在图 7A 这个案例中，我们在多组分图里能看到部分孔是有正常扩增的，但是 CT 值一栏却都显示 Undetermined。当我们在扩增曲线图下方的 Options 中勾选上「Show: √Threshold」的时候，会发现自动阈值线设得特别低，跟扩增曲线没有交点（图 7B）。回顾我们前面说过的，CT 值是根据扩增曲线与阈值线的交点来计算的，那么当阈值线与扩增曲线没有交点的时候，没有 CT 值也就毫不意外了。

图 7 阈值线设置太低导致没有 CT 值

再说回这个案例，为什么自动阈值线会画得那么低呢？其实是因为很多没有加试剂和模板的孔（C-H 行）都被设上了 target 和 sample，那么软件就会认为这些孔里是有反应体系的，是应该有信号的，因此在计算阈值线的时候就把这些孔都算进去了，导致阈值线画得特别低。我们把空孔中分配的 target 和 sample 清除掉，再重新分析，阈值线就正常了，也能得到正常的 CT 值了（图 8）。

图 8 去掉空孔后自动阈值线就画在了合适的位置

在有些案例中，阈值线甚至可能低到坐标图中都看不见的程度，这个时候就可以从 Options 中 Threshold: √Auto 之后的框里显示的数值来查看阈值线的值。如果阈值线的位置不合适，可以去掉 Threshold: √Auto 里的√，再手动拖拽图中的阈值线至合适的位置或者直接在 Threshold 的框里输入合适的数值，再重新分析就可以得到正常的 CT 值了。

案例 6：

除了阈值线位置不合适，我们也碰到过明明阈值线位置正常，但 CT 值也显示「Undetermined」的情况。比如图 9 的这个案例，有扩增曲线，阈值线的位置也正常，但大多数孔仍然不显示 CT 值。这又是什么原因呢？

图 9 阈值线位置正常，但没有 CT 值

我们在查看数据的时候发现有大量的孔里显示了一个黄色的三角，里面有数字。这个黄色的三角代表软件对结果进行 QC 的时候发现了异常，三角里的数字就代表了这个孔里 QC 异常的项目数量。而从 QC Summary 中可以看到，这个数据中大部分孔报了「BLFAIL」，也就是基线分析失败（图 10A）。至于基线分析失败的原因，从图 10B 中的多组分图可以看到，这些孔的基线期荧光值特别低，接近于 0 了。正常来讲，反应体系中加了荧光染料，即使没有扩增也是有背景荧光的，这种背景荧光特别低的情况可能与客户使用了透光性不佳的耗材导致采集到的荧光值偏低有关。

图 10 基线分析失败导致没有 CT 值

由于荧光定量实验需要根据每个孔的荧光值变化来进行分析，所以必须使用与仪器配套的、透光性能较好的耗材，才能得到好的实验结果。这个实验由于采集到的荧光信号有问题，在实验结束后也无法再修改了，只能换用合适的耗材重新做实验了。

扩增曲线正常但没有 CT 值的原因通常与阈值线或基线的设置有关，而如果扩增曲线异常，往往也是得不到正常的 CT 值的。

案例 7：

这个案例是比较常见的一种情况，扩增曲线不正常，CT 值都显示「Undetermined」（图 11A），但看多组分图时发现报告荧光有正常的扩增曲线，而 ROX 的荧光值却在 0 的位置（图 11B）。显然，这是使用了一种不含 ROX 的试剂，但未取消 ROX 分析导致的。这个数据只要在分析设置中将 Passive reference dye 从默认的 ROX 改成 None，再重新分析就可以得到正常的结果。

图 11 未加 ROX 导致扩增曲线异常

案例 8：

再来看一个相对少见一点的案例。在这个案例里，也是只有杂乱的扩增曲线，无法获得 CT 值（图 12A）。而查看多组分图时发现，这个实验其实是有扩增的，但原本应该平直的 ROX 荧光曲线却呈现出一个跟 SYBR 颠倒对称的图形（图 12B）。我们查看 Raw data 时发现其第一通道荧光（FAM）是正常上升的，第四通道荧光（ROX）也是维持在正常水平，这就怀疑可能与校准文件异常有关。这台仪器在重新做了 SYBR 荧光校准以后，扩增曲线就恢复正常了，也能得到正常的 CT 值。

图 12 校准文件异常导致曲线异常

关于扩增曲线异常的更多案例分析可以参考我们之前的推文《荧光定量 PCR 异常扩增曲线分析攻略》，这里就不再一一列举了。

案例 9：

当然，没有得到 CT 值也有可能真的是没有扩增。比如图 13 的这个案例，在扩增曲线图中只看到杂乱的信号（图 13A），换到多组分图就能看出来 FAM 全是平直的线，完全没有荧光信号的抬升（图 13B），所以这种情况下就需要排查实验方面的问题了，看看是什么原因导致没有扩增。

图 13 没有扩增导致没有 CT 值

最后，还有两个特殊案例，是跟仪器类型有关的，并非在所有型号的仪器中都会发生。

案例 10：

这个案例使用 StepOnePlus 做荧光定量实验，实验结束后大部分孔没有得到 CT 值，扩增曲线也很异常（图 14A）。我们查看多组分图发现整体信号其实是有扩增的，但荧光信号反复上下波动，而且 40 个循环的扩增反应一共采集了 80 次信号（图 14B）。我们再查看 Run Method 设置会发现，这个实验在循环中的退火和延伸步骤都采集了信号（图 14C），由于温度会影响荧光强度的高低，所以就得到每个循环 2 个强度不同的荧光信号值，最终呈现为 80 个上下波动的荧光信号。由于这次的实验已经结束，数据就无法挽救了，但从图形上看这个实验应该是有扩增的，所以只需要重新做一次实验，并且在退火或者延伸步骤中选择一步采集信号就可以了。

图 14 StepOnePlus 两次采集信号导致没有 CT 值

其实我们仪器本身默认的运行程序都是只采一次信号的，所以大家在根据自己的条件修改运行程序时需要注意不要误点了采集信号的开关。另外，这一问题除了 StepOne/StepOnePlus 的机型，在 AB 的其它机型中不会出现，因为 7500 的软件限制了在循环阶段只能在一个步骤采集荧光，而 QuantStudio 系列机型则可将循环中不同阶段采集到的荧光分开分析（在 Analysis Settings 中可以进行选择），就不会导致结果出现这样的错误了。

案例 11：

有客户反馈在 7900 上做 AQ 实验的时候结果正常，有 CT 值；而做 RQ 实验的结果明显有正常的扩增曲线，但是没有 CT 值（图 15A）。其实这个实验在软件设置本身并没有什么问题，问题在于 7900 的 RQ 实验不是用 SDS 2.4 的软件分析，而需要使用 RQ Manager 软件分析（RQ Manager 是安装 SDS 2.4 软件时一同装上的）。这个数据导入 RQ Manager 后再分析就能得到 CT 值了（图 15B）。

图 15 7900 的 RQ 数据要用 RQ Manager 软件分析

与此类似的还有 7500 v1.x 版本的软件，如果做了 ddCt 的实验，然后在软件中直接打开分析的话，也是只能看到扩增曲线，却没有 CT 值一项。这时候需要新建一个 ddCt Study，然后再导入 ddCt 的实验，就可以正常分析得到 CT 值了。

从这么多案例中，我们也能看出来：一个 QPCR 实验要正常获得 CT 值的数据，好的实验设计、试剂样本、仪器耗材和正确的软件操作都必不可少。当您遇到实验结果没有 CT 值的问题时，不妨参考我们列出的案例，从以上几个角度进行分析，看看能否找到问题所在。如果碰到仍然解决不了的问题，也欢迎您联系我们赛默飞的技术支持，我们将尽力给您提供帮助。

说了这么多，对于上篇文章开头的「灵魂三问」：

「为什么我的实验没有 CT 值？」

「是我的实验/试剂/引物/仪器/操作有问题吗？」

「我的实验必须要重做吗？」

您是否已经有答案了呢？