设计引物的小技巧除了从TM值，GC含量，专一性（基因特定区域）考虑，还有别的吗

看你的目的了，如果是realimte的引物，还需要跨内含子。普通pcr的话，还要看酶切位点。

3 末端稳定性，发卡结构， 多义性，二级结构等

• 碱基要随机分布。
• 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
• 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
• 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
• 扩增产物的单链不能形成二级结构。
• 引物应具有特异性。