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养大鼠平滑肌细胞的一点心得

我养了快半年的大鼠气道平滑肌细胞,有一点体会,特发上来和各位战友交流一下,互相进步。 壹. 器械 显微器械:眼科剪一把,直弯眼科镊各一把,细结镊一把,手术刀一把,针头诺干 杀老鼠器械:手术剪一把,大镊子一把,弯眼科镊一把,组织钳一把,50ml烧杯一个(锡纸包好) 另外:10ml离心管两个,培养皿两个,10ml的瓶子三个,小滤器两个,硅胶板一块,培养瓶盖子诺干 贰。试剂 D-HANKS液250ml,双抗2ml(青霉素16万U/ml链霉素15万U/ml),一型胶原酶,木瓜酶,BSA。后三种加上D-HANKS配成1ml的消化液,终浓度皆为1mg/ml。无血清DMEM和含20%FBS的DMEM 叁。步骤 1. 取大鼠,称重,水合氯醛0。3ml/100g腹腔麻醉 2. 绑好大鼠,先剪开腹腔,剪断腹部大动脉放血,后剪开胸腔,取肺 3. 放入烧杯,后移入超净台,置于冰盒上。以后的操作皆在冰盒上操作 4. 倒入已加双抗的D-HANKS,清洗肺部,扯掉食管,剪掉心脏 5. 用针头将肺固定在硅胶板上,硅胶板置于培养皿里 6. 用镊子将肺的内外膜除去,只剩下平滑肌

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牙周膜细胞和牙髓细胞的培养方法

牙髓细胞的培养 1、 培养用液: PBSA ; 胶原酶: I 型,用 D - Hank’s 液配制, 625U/ml ; 培养液: DMEM + 10 % FBS ; 2、 Protocol : u 取拔除的正畸牙或阻生牙(年龄小者较佳),尽量完整的取出牙髓,置于培养皿中,用 PBS 冲洗; u 将牙髓放入离心管,加入胶原酶 2 - 3ml/ 牙, 37 ℃ , 2 - 3 小时(原则是将牙髓消化彻底 ); u 加入等量培养液,吹打至单细胞,离心,重悬,接种,牙 /6well ; 牙周细胞的培养 1、 培养用液: PBSA ; 胶原酶: I 型,用 D - Hank’s 液配制, 625U/ml ; 培养液: DMEM + 10 % FBS ; 2、

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常用细胞凋亡检测方法(五)

七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析   TFAR19(PDCD5)是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因,前期的功能研究表明,它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素(FITC)标记的TFAR19单克隆抗体为探针,对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现,凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象,伴随着细胞核形态学的变化,持续较长时间,在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现,凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和细胞核DNA的片段化,提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明,凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义,不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件,提供了一种新的技术和指标。   (一)TFAR19蛋白的细胞定位分析   材料试剂: FITC标记的单克隆抗体,pH7.4 、0.15Mol/L PBS,3%的多聚甲醛,PBS-T(pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20),胎牛

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细胞爬片的方法与心得

细胞爬片是细胞培养中比较经常会用到的,现将自己操作的一些方法与技巧拿与大家分享,如有不当的地方还望大家给与指正: 【爬片的准备】 1、爬片可用一般的盖玻片,也可用专用爬片; 2、应用盖玻片,可根据自己的需要剪裁成合适的大小,以备置于6孔板、12孔板或24孔板; 3、将剪裁好的爬片,置于浓硫酸中浸泡并过夜,第二天先用自来水冲洗20遍,再用三蒸水冲洗3遍(个人认为主要目的是冲洗干净就可以了),放在饭盒或者培养皿(一定是玻璃的哦,要不然就……)中烘干后进行高压消毒。 【培养板的准备】 1、 泡酸过夜 2、 冲洗,烘干(1、2步骤与前大致相同) 3、 放入超净工作台用紫外线照1~2小时就可以用了(在照之前可以将爬片一并放入,若细胞贴壁能力不强,可经多聚赖氨酸浸片后放入。贴壁能力强的话,就可以省略了,进行紫外线消毒) 注: 此步自己的经验是爬片可以先浸入消毒后的PBS内,紧接着放入培养板内。目的:浸过PBS的爬片依靠表面的液体,可以用培养板孔底贴和紧密,以利于细胞长到爬片上。(自己刚开始做的时候,经常就是细胞全都长在了爬片与培养板之间,爬片上细胞罕见。) 【细胞爬片】

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EB病毒诱导淋巴细胞永生化实验方法

实验步骤: 1. EB病毒液的制备  复苏B95.8细胞株,使用培养基为10% FCS RPMI-1640  逐步添加培养基至细胞长至对数生长期  细胞计数,调节细胞数量为1×106个/ml  在CO2培养箱中继续续培养10天,中间不换液  至第10天收集培养上清,1800rpm,4℃离心15分钟  0.22μm滤器过滤,1ml/支分装,冻存于液氮备用 2. 病人外周血液的采集、分离  使用枸橼酸钠抗凝管采集恢复期病人外周血10ml,尽量在24h内进行分离  平衡盐(BSS, balanced salt solution)溶液配制(请具体参见淋巴细胞分离液使用说明): Solution A Anhydrous D-glucose 0.1 percent 1.0 g/l CaCl2 × 2H2O 5.0 × 10-5 M 0.0074 g/l MgCl2 × 6H2O 9.8 × 10-4 M 0.1992 g/l KCl 5.4 × 10-3 M 0.4026 g/l TRIS 0.145 M

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血清热灭活的问题

血清热灭活�您是否在浪费时间? 血清的热灭活是很多培养者感兴趣的话题,价格不菲的血清中含有诸如生长因子,维生素,氨基酸等珍贵物质,而将它们置于50℃以上的温度长达30分钟是完全没有必要的。尽管如此,在大多数实验室之中血清的热灭活还是作为常规来执行,多数实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子,氨基酸等成分带来的负面影响,在我们的技术热线中最常被提到的就是否该对血清进行热灭活,下面我们就对胎牛血清的热灭活进行一些探讨和解释。 根据调查,至少70%的研究者对血清的灭活仅仅是因为遵照常规操作,或者说认为是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间,而时间则从15分钟到60分钟不等.其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高,许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立,只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。 热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质,但是在胎牛血清中对补体的灭活则明显没有必要。Triglia和Linscott[1]曾对商业胎牛血清中的补体成分进行测定,他们发现胎牛血清中含有的C1,

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MTT 与 CCK-8 测定细胞毒性和增值的优劣比较

Cell Counting Kit-8 简称 CCK-8 试剂盒,是一种基于 WST-8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8 是一种类似于 MTT 的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的 formazan。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。WST-8 & MTTWST-8 是 MTT 的一种升级替代产品,和 MTT 或其它 MTT 类似产品如 XTT、MTS 等相比有明显的优点。首先,MTT 被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的 formazan 不是水溶性的,需要有特定的溶解液来溶解;而 WST-8 和 XTT、MTS 产生的 formazan 都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤。其次,WST-8 产生的 formazan 比 XTT 和 MTS 产生的 formazan 更易溶解。再次,WST-8 比 XTT 和 MTS 更稳定, 使实验结果更加稳定。另外,WST-8 和 MTT、XTT 等相比,线性范围更宽,灵敏度更高。该方法已被广

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大鼠内皮细胞的培养方案

本人总结了下大鼠内皮细胞的培养方案 一,消化法。优点:获得的细胞比其他方法纯。缺点:获得细胞比较少。 常见问题及解决方法:1.消化的时间不好控制时,建议大家分两段时间消化,消化30分钟时收取消化液放入一个离心管,30分到45分钟段收集的放入另一离心管,离心后看看第二管是否有杂细胞,若没有就把两管混合用,若有就只用第一管的。2.消化液,我的经验是5份0.2%胶原酶和1份0.125%胰酶。3.若很难消化时,可以磁力搅拌消化。注意消化法时结扎一定要紧! 二,植快法。优点:获得细胞比较多。缺点:很多,动脉小不好操作,动脉快不好内面朝下,容易浮起来等等。而且成纤维细胞比较多也不好除去。 常见问题及解决方法:1.动脉太小不好移动时,把弯的吸管头在酒精灯上多烧一会,冷确后一块一块吸到培养瓶,30快就差不多了,1mm3大小。2.容易浮起来时,预先要铺明胶,把动脉快移进去后不要加培养液,直接放到培养箱,4到5小时后再加。因为吸动脉快时动脉块是湿润的。3.除成纤维细胞要用细胞刮刀慢慢刮了。 三,植环法。优点:获得细胞比较多,比植块法稍简单,除成纤维细胞也简单。缺点:有成纤维细胞。 常见问题

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关于动物血清的常见问题及处理方法

最近在培养细胞中使用胎牛血清,由于发现有沉淀,不知是否变质,在查阅相关文献也没有得到确切的答案.因此不敢再用原来的血清,导致浪费.在这提醒大家做细胞培养时,要注意血清的分装. 血清是细胞培养中最重要的元素之一。在实验室操作中要注意及处理方法: 1. 血清保存: 建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而,若存放于4℃时,请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶,建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。 2. 解冻血清的方法: 建议您将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。 3. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理? 血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。 若您欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些

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细胞消化的个人经验小结

一、酶消化法。 1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大,从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞,在37度条件下,一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液,否则影响活性。保存于-20度。 2、胶原酶。这种方法比较少,一般是用原代培养时,从组织消化下细胞。这种方法作用温和,对细胞损伤较小,但是,价格也较贵。中止同样是用血清。 二、离子螯合剂:不破坏细胞表面分子,仅与CAMs螯合,因此,如果检测细胞表面分子的话,尽量,甚至是一定不要用酶消化法。 1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质,对细胞间也有一定作用。注意,它能显著影响pH值,而且在弱碱性条件下才易溶。因此,配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此,消化下来的细胞要洗一遍。 2、商品化的无酶消化液。个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大,但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。 三、物理法。直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。 四、

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体外肝细胞损伤模型建立(CCl4和H2O2)

1 大鼠肝细胞的分离和培养 大鼠4%戊巴比妥麻醉,门静脉插管,先以无钙灌流液灌流,继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内,轻轻撕去肝包膜后,加入含5%小牛血清的清洗液,用吸管吹打成单个肝细胞悬液,200目尼龙网过滤,低速离心(500 r・min-1,1 min,4℃)弃上清,同法用清洗液反复洗3次。然后用完全1640培养液(内含10%小牛血清,105 U・L-1青霉素,100 mg・L-1链霉素和10 mg・L-1胰岛素)制成1×109个・L-1肝细胞悬液。分离的肝细胞经0.6%台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90%,高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99%为肝实质细胞。   将上述肝细胞悬液分别加入24孔(每孔1 ml)和96孔(每孔0.1 ml)培养板中,置37℃,5%CO2培养箱中培养。12~16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。  2 CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立 肝细胞培养12 h后,吸弃上清,更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔(1~16 mmol・L-1),以少量的二甲亚砜助溶,二甲亚砜终浓度为0.1%(体积

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体内肝损伤模型(酒精)

一、材料 纯系SD雄性大鼠,体重180g~200 g,由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用酒精选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。 二、方法 将大鼠随机分成5组,饲养在23℃~25℃室内,自由进食、进水;根据大鼠体重,A、B、C、D组每日用56°红星二锅头白酒以10ml/1Kg分别灌胃 0、4周、8周和12周;E组于酒精灌胃12周后,停止灌胃4周。大鼠通过股动脉采血处死,收集血浆和肝脏标本。 三、主要指标检测 (一)肝功能:应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、球蛋白(Glb)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)等。 (二)氧化抗氧化物质测定:采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。 (三)大鼠肝脏病理检查:大鼠处死后立即取出肝脏,称重后一部分以10%的福尔马林液固定作病理,作常规石蜡切块并HE染色,在光学显微镜下进行观察,用半定量法分别判定脂肪变性、及酒精性肝

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常见体外肝细胞损伤模型

1.四氯化碳体外损伤肝细胞模型 原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h(贴壁良好)后,置培养皿于一密闭的塑料盒,内置四氯化碳0.4M容积,37度90min,造成肝细胞损伤的模型,后转入正常培养,进行下一步实验。(即熏蒸法) 肝细胞培养12h后,吸弃上清,更换培养液并加入CCL4 8mM(事先用DMSO溶解,DMSO终浓度1%),作用6h后收集24孔板中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒GSHpx活性,评价损伤程度。(常用方法) 2.醋氨酚体外损伤肝细胞模型 肝细胞培养24h后,用清洗液洗2次,培养液洗1次,然后换以20mM醋氨酚的培养液,继续培养12h,取培养液,进行下一步实验。 3.过氧化氢体外损伤肝细胞模型 肝细胞培养24h后,吸弃上清液,更换培养液并加入H2O2 0.6mM,作用1h后,收集24孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含量。 4.氰化钾缺氧肝细胞损伤模型 肝细胞培养24h后,贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾2.5mM,继续培养2h,定量检测培养液上清中LDH活性,以及酶的活性反应肝细胞损伤程度。本模型可以更好的模拟缺氧损伤。

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帕金森体外模型

体外培养的中脑多巴胺能神经元MPTP损伤模型 l实验操作:实验采用胚胎龄14一16天的大鼠,剖子宫取胎,取胎鼠中脑腹侧区。可将多个胚胎来源的组织收集在一起,置Fl2培养基(Gibco)至35mm的培养皿中,以细剪刀剪碎。将2ml含0.125%的胰酶的F12加入到组织中,该混合物于37oC孵育10分钟后,加入DNase I(Sigma)至终浓度80ng/m1,继续于37oC孵育10分钟。消化后的组织以尖端被火抛光的移液管轻轻吹打8次。该细胞悬液以种植培养基稀释(种植培养基: MEM,补充以2mm谷氨酰胺,6mg/ml葡萄糖,1mg/ml谷胱甘肽,10 units/ml青霉素,10ul/ml链霉素和7.5%胎牛血清)。细胞然后种植于35mm的预先以10ug/m1 po1y1ysine (Sigma)和2.5ug/ml merosin(Chemicon)铺底的培养皿中,种植密度为50,000细胞/cm2。培养16小时后,培养基换为无血清培养基。该培养基为F12和basa1Eag1e’s medium,补充以33mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺, 15 mM碳酸氢钠,10mM HEPES(pH

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Aβ损伤模型

取出生1-2d的乳鼠,用麻醉剂处死。在D-hanks液中取大脑并分离海马组织,胰蛋白酶消化,获得细胞悬液,胎盘蓝染色进行死活细胞记数,将细胞以5×105/ml的密度接种于预先经L-多聚赖氨酸处理的96孔和24孔培养板,其中24孔板中预先放置有盖玻片。细胞维持在培养液中,置入5%CO2,饱和湿度的培养箱中培养,24h后全换液,接种当天为第一天,每3d半量更换培养液一次,培养第3天时加入阿糖胞苷,终浓度为10μmol/L,以抑制神经胶质细胞的过度增殖,24h后更换全部培养液继续培养,第10天进行细胞造模,开始实验。 也可以用PC12细胞株,常规培养 Aβ产物诱导海马神经细胞,建立细胞模型: 选择Aβ25-35片段,用三蒸水配制成100μmol•L-1,过滤,分装,-20℃冻存;使用前老化处理并配制成所需浓度。(将Aβ25-35溶解在DMSO中,在用DMEM稀释,置于37℃下孵育7-14天,即为老化状态)。 细胞模型建立:加入浓度为20µmol/L的Aβ25-35,接触24h,诱导建立AD细胞模型. 检测指标:MTT LDH 凋亡 细胞内钙离子 以及SOD等

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抑郁症的体外模型

抑郁等精神疾患的发生可能与过量GC对海马的选择性损伤有关,但机理不明,Heuser和Cosi等报道可能是由于高浓度GC导致神经营养因子表达水平降低造成的,而抗抑郁剂不仅使GC受体上调,HPA轴反馈恢复正常,而且使神经营养因子表达升高,达到治疗目的.PC12细胞株为大鼠嗜铬细胞克隆化细胞株,分化的PC12细胞有典型的神经细胞特征,其胞膜上GC受体表达丰富[6].本文根据文献方法以高浓度皮质酮(corticosterone)模拟抑郁及焦虑症神经细胞损伤状态 实验操作(MTT法测定细胞存活力) 嗜铬细胞瘤株PC12细胞.用含5%胎牛血清及5%马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU.L-1,链霉素100mg.L-1pH7.4)调细胞密度为2x108L-1接种于预先用多聚赖氨酸(0.1g.L-1)处理过的96孔培养板,每孔10LL,放入CO2孵箱,培养3~4d,待细胞长满孔底后即可用于实验.参照文献方法,稍加修改,吸去细胞液换上含有相应浓度药物及0.2mmol.L-1皮质酮的无血清DMEM(对照组不含任何药品),培养48h,吸去培养液,用D2Hanks液洗2遍,每孔加入含0.5g#

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UVB致皮肤角质形成细胞的损伤模型的制作方法

材料和方法 1 试剂:胎牛血清(北京军医兽医防治中心) ,DMEM培养液(GIBCO ,美国) ,碘化丙啶PI(Sigma) ,Triton2X100 (BDH) ,Hoechst33342(Sigma) ,RNase (Sigma) 。 2 细胞及实验分组:人角质形成细胞株Colol6 (由北京师范大学生物系提供) 。分单纯对照、单纯照射、给药后照射、照射后给药4 组。给药后照射组为在照射前24 h 给药,照射后24 h 进行检测,照射后给药组为在照射后立即给药,照射后24 h 进行检测。 3 紫外光源及照射条件:光源为UVB 紫外灯管(上海金光灯具厂,6W) ,剂量率为6J・m- 2・min - 1 (由吉林大学环境卫生教研室进行测量) 。 4 药物种类:人参三醇组甙、Rg1、Rb1 由吉林大学有机化学教研室提供。 5 细胞周期:胰酶消化贴壁细胞,接种于24 孔平底培养皿中(5 ×105 细胞P孔) ,每孔先加300μl DMEM 培养液(含15 %胎牛血清) ,待紫外线照射后,加至1 ml ,置37 ℃、5 %CO2孵箱中。收集细胞, 0101

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125I-UdR致C6胶质瘤细胞损伤的模型

一、材料:125I-UdR购自中科院北京原子能所,放化纯度>95%。脱氧腺苷(AdR)、脱氧鸟苷(GdR)、脱氧胞苷(CdR)、脱氧尿苷(UdR)均为Sigma公司产品。 二、方法 1、细胞培养:当癌细胞贴壁生长超过瓶壁的70%,用胰蛋白酶消化30-40s,传代培养。肿瘤细胞每3-4d传代1次。在50ml培养瓶中,细胞数达2×106个细胞后,取处于对数生长期的细胞进行细胞存活实验。 2、细胞存活实验:将制备好的细胞按1×105个/ml细胞接种于25ml的培养瓶中,培养20小时,实验组加入125I-UdR74KBq/ml及不同浓度的AUCG(10μM、20μM、30μM、50μM、80μM)再共同孵育24h后,100倍的倒置显微镜下观察细胞形态,收集细胞,制成单细胞悬液,调整细胞密度,接种于25ml的培养瓶中,2-3d后换液,8-9d后细胞集落形成,每个剂量点设复瓶4瓶,同时设对照组未加AUCG,另设空白组,均为4个复瓶。计算细胞存活分数,绘制细胞存活曲线。 三、检测方法 1、采用TEM技术观察凋亡细胞超微结构:上述细胞用3%戊二醛固定后,PBS漂洗,1%

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神经胶质细胞的制备和培养

1)取新生一周内大鼠,碘酒、酒精浸泡消毒后快速断头; 2)用眼科剪和镊剪除皮肤和颅骨,分离皮肤和颅骨时用不同的器具,弯剪剪取部分大脑皮层至60mm培养皿,培养皿内提前放置D-Hanks溶液; 3)解剖镜下取出脑膜及血管,转移组织至另一盛有D-Hanks溶液的器皿,将组织剪碎为1mm3左右的小块,然后小心转移至带螺帽的离心管内; 4)0.125%胰酶消化15-30分钟,以含10%胎(小)牛血清的DMEM培养基终止消化,巴氏吸管吹打,100目筛网机械过滤,制备混合细胞悬液; 5)计数,调整细胞密度,根据需求按适当密度种植于培养瓶或皿内; 6)放置于含5%CO2的37℃恒温培养箱,2-3天后换液,去除死亡及未贴壁细胞,以后每3-4日换液一次; 7)约两周后当细胞基本铺满时可在培养液中加用二丁酸环腺苷(dBcAMP,0.25mmol/L),该物质被认为有促进细胞分化和抑制小胶质细胞生长等作用; 8)根据细胞生长状况对培养细胞进行传代,多数文献建议用传代3-5次的星形胶质细胞进行实验,但一般不在换液或传代的当天; 少突胶质细胞和小胶质细胞的培养尚需在星形胶质细胞培养基础上进一

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Langendorff离体心脏缺血再灌注方案

采用美国Radnoti公司Langendorff离体心脏灌流系统,观察离体心脏功能变化,可排除其它组织器官、循环代谢产物的干扰。 实验步骤: A. 配制37℃ K-H液(1.25 CaCl2,130 NaCl,5.4 KCl,11 葡萄糖,0.5 MgCl2,0.5 NaH2PO4及25 NaHCO3),向K-H液中通入95%O2-5% CO2气体,缓冲液PH 值为7.4,并取部分K-H液放入冰箱中,使其温度降到4℃。 B. 清洁Langendorff管路,每次使用前先用1000ml蒸馏水冲洗,打开水浴循环,再用K-H液将整个管路系统进行冲洗。 C. 鲁米钠腹腔注射麻醉动物(100mg/kg),并向肝静脉注射100IU肝素,颈动脉放血处死动物,同时快速分离心脏,放入4℃K-H液中挤净血液并称重。 D. 将心脏迅速固定在Langendorff 灌流系统中,通过主动脉以85cmH2O压力逆行灌注,通过肺静脉插入导管至左心房。 E. 心脏复跳后,将一个球囊插入心脏左心室,球囊和压力换能器相连,在电脑上记录左室内压,调整左室舒张内压(LVEDP)在4~10mmHg之间

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