不用试剂盒的凝胶回收（来自网络） 2008-01-09 15:41:32| 分类： 分子生物学实验室 | 标签： |字号大中小 订阅 .（1）用小针头在0.5ml离心管底部打洞，用玻璃棉塞住离心管底部。（2）紫外透射检测仪下观察，用小刀片小心切出含有目的片段的凝胶。（3）将凝胶条放入0.5ml离心管中，外套1.5ml离心管，8000rpm离心3分钟。用微量取液器吸取1.5ml离心管中的液体，转移到另一干净的1.5ml离心管中。然后重复离心，直到将凝胶条中的液体全 ...
反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。与之相关的研究技术称 ...
质粒DNA的提取与鉴定( 一)收获细菌（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ML的试管中，接入一单菌落，于37度剧烈振荡培养过夜（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4度以12000g离心5min，将剩余的培养物储存于4度（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥2碱裂解法小量抽提质粒 （1）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl ...
一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有 ...
美国FDA已批准用RNAi进行临床研究。我国要加快进行RNAi临床前研究，需合成单位、研究单位和药厂通力合作，请各位对合成siRNA的成本降低、修饰、靶向给药、体内给药方式和剂量、药代动力学方法等提出宝贵意见。以便联系合作和互相促进、共同提高。附上RNAi临床前研究和临床新进展。4364753@sina.com.cn近据国外医药信息刊物报道，一种全新生物工程药品“RNA干扰剂”(非干扰素)业已浮出水面并有望在3年内上 ...
小弟最近在做荧光定量。由于荧光定量的灵敏性，一个处理组如果只做3个生物学重复（即每个处理组取3尾实验动物，分别提RNA，分别反转录，做定量），那个体之间的差异，势必会使实验结果难以分析。【以上内容可参考： http://www.dxy.cn/bbs/topic/16659187 下文中，第1种思路类似该帖中第1种情况。】为了增大样本量，以更好地估计总体，同时为了减小个体间的差异对实验的影响，且为不使试验成本过高，我身边的人有以下3 ...
近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。 医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR ...
LAMP法的原理该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在l5～6O min扩增1O^9～lO^10 倍；特异性高，所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应用浊度仪检测沉淀浊度来判定的1．引物的设计：基于靶基因3'端的 ...
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信 ...
进行一次成功的连接实验需要优化一系列实验指标。A）载体和插入片段的摩尔浓度比特别重要，载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。B）进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平 ...
1. 对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。美国著名RNA产品公司Ambion提供网上在线设计工具，帮助您更快地完成这项工作。网址为：www.ambion.com/tec ...
一旦生物样品被收集采摘，它的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解，或者由于应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。对于生物芯片、基因表达矩阵分析（Array Analysis）、定量RT-PCR等实验来说，采 样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是精确/定量研究基因表达分析的重要前提。为了达到这个目的，往往需要将液氮或者干冰带到采样现场，采样后立即运回实验室保存。 ...
设计原则：1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。3.Stratagene发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔 ...
2，3－DPG：2，3－diphosphatidylglyceric acid，2，3－二磷酸甘油酸2－CdA：2-chlorodeoxyadenosin,cladribine，2－氯去氧腺苷3H－TdR：tritiated thymide，氚标记胸腺嘧啶核苷5－Aza：5-azacytidine，5－氮（杂）胞苷a2-PI：a2-antiplasmin, a2－纤溶酶原抑制物AA：aplastic anemia，再生障碍性贫血AAV：aden ...
1：DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克 ...
1．溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强 ...
芯片实验设计要点作为一种高通量的实验平台，基因芯片可以同时对多至上万个基因进行表达水平的监测。考虑到芯片实验本身的高成本，实验前对整个实验方案的认真设计就显得非常重要。影响芯片结果的主要方面包括被检测实验材料本身，芯片实验过程，数据处理过程。实验材料实验材料的选用直接影响到最后结果的解释。在选择时要注意以下几点：1.根据实验需要达到的目的，首先要求实验材料具有代表性，如临床标本的取材部位，病人的临床诊断是否明确 ...
PCR问题的总结pcr产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 pcr反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④pcr循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变 ...
活体电穿孔法介绍1、什么是活体电穿孔活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞 。近年来活体 ...
我做质粒小量提取,刚开始的几次实验都没有理想的结果,分析来分析去发现问题可能是培养时间的问题:将菌种从-70度接到LB培养基37度过夜,再用此菌液涂平板获得单克隆,用EP管取1.5毫升LB培养基,用接种环每挑一个菌落每接种一管(将挑到的菌落全洗下去),37度培养约13个小时,直接按照"分子克隆"提供的碱裂法提,结果一无所获.后来在师兄的提醒下我想到是否是因为培养时间过长而使质粒缺失?于是我测了此菌的大致生长曲线,发 ...
