【交流】不同个体RNA混合后浓度为什么会变高？关于荧光定量中biological replicate和technical replicate

小弟最近在做荧光定量。

由于荧光定量的灵敏性，一个处理组如果只做3个生物学重复（即每个处理组取3尾实验动物，分别提RNA，分别反转录，做定量），那个体之间的差异，势必会使实验结果难以分析。
【以上内容可参考： http://www.dxy.cn/bbs/topic/16659187 下文中，第1种思路类似该帖中第1种情况。】

为了增大样本量，以更好地估计总体，同时为了减小个体间的差异对实验的影响，且为不使试验成本过高，我身边的人有以下3种思路：

1.每个处理组取9尾实验动物的组织（如，肝脏），然后每3尾实验动物的肝脏混合匀浆，得到3份混合样品，提RNA，反转录得3份cDNA，再做荧光定量；

2. 每个处理组取9尾实验动物的组织（如，肝脏），9尾实验动物单独加Trizol匀浆、加氯仿，在加氯仿之后吸上清时，每3份吸等量上清混合，进行后续步骤，得到3份RNA样品，后续步骤同上；

3.每个处理组取9尾实验动物的组织（如，肝脏），9尾实验动物单独提取RNA，将提得的RNA，每3份混合，得3份RNA混合样，反转录得3份cDNA，荧光定量；（RNA混合原则：RNA混合前测浓度，每份RNA取1μg，组成混合RNA，即每份混合样中含3μg RNA；测RNA混合样的浓度，从每份RNA混合样中取1μg RNA进行反转录）。

小弟认为，以上3种思路中，1和2实际为同一种方法，但其有缺点，如果第一步加的组织重量不同，那么将他们混合，就属于一种不平衡混合；至于3，从每个样品的RNA中中取1μg RNA组成混合样品，所以不存在不均衡混合的问题。

所以小弟今天就尝试第3种方法，可是问题来了。
就是混合之后的RNA浓度高于各单个样品的RNA浓度。
举个例子，我吸取1μl的1000ng/μl的RNA（第1个个体）、0.8μl的1250ng/μl的RNA（第2个个体）、0.5μl的2000ng/μl的RNA（第3个个体），组成混合RNA样品，结果得到的RNA浓度却为4000+ng/μl，比这3个RNA浓度都高!!!怀疑是RNA未充分溶解，故将RNA涡旋、离心，4℃静置数小时，仍得同样的结果；混合前后RNA质量均没问题，260/280在1.95左右。

【据此，我提出以下3个问题】：
1. 大家平时在做荧光定量时，通常做几个生物学重复？当生物学重复>5时，是否还做技术重复（复孔）？
2. 对于我提到的3种方法，大家更倾向于哪一种？
3. 哪位高人指点一下，为什么将RNA混合后，浓度会变大？难道不同样品RNA之间存在某种作用？