基因芯片实验设计要点 有用请顶!
丁香园
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芯片实验设计要点
作为一种高通量的实验平台，基因芯片可以同时对多至上万个基因进行表达水平的监测。考虑到芯片实验本身的高成本，实验前对整个实验方案的认真设计就显得非常重要。影响芯片结果的主要方面包括被检测实验材料本身，芯片实验过程，数据处理过程。
实验材料
实验材料的选用直接影响到最后结果的解释。在选择时要注意以下几点：
1.根据实验需要达到的目的，首先要求实验材料具有代表性，如临床标本的取材部位，病人的临床诊断是否明确，同时要考虑疾病本身的多样性背景等等；
2.其次根据材料的特性选择合适的实验路线，如材料来源的难易，材料的类型（细胞或组织或其它生物类型），对于来源较困难的样品，需要对其进行适当的处理（如体外扩增）；而对于来源充足的样品，则可以直接用于芯片实验而避免体外处理带来的系统性误差；
3.最后是取材过程的控制，基本要求是快速准确，同时注意样品保存条件的合理性。
芯片实验过程
1.首先是芯片实验的重复性要求
一般情况下芯片实验要求有独立的重复性实验以减少假阳性或假阴性结果的产生，但是考虑到实验的成本，也有研究人员采用一次芯片实验的结果作为参照通过其他低成本的方法如RT-PCR，NORTHERN BLOT等方法对感兴趣的结果进行确认；当然如果不存在成本方面的考虑，可以完成更多次的芯片实验以得到统计学上的分析意义，特别是对于临床上复杂疾病的研究，个体的差异性和诊断学上的差异性往往会掩盖或突出某些相关或不相关的基因表达信息，对于多个不同个体和病理类型的筛差可以得到更多与临床诊断相关的信息，许多临床肿瘤学的研究都采用了多样本的芯片实验。
2.其次是选用的芯片类型，如寡核苷酸芯片或cDNA芯片的具体实验操作是有所不同的。
3.如果采用多次的芯片实验，其实验设计又可以分为直接比较和间接比较两种；前者采用不同实验组与不同对照组或同一个对照组直接进行比较，后者则以不同实验组和不同对照组或同一个对照组与同一个参照样品分别比较，最后得出实验组与对照组间的变化关系。
4.不同的实验方法对于实验系统的要求以及引入的系统性误差是不同的。如反转录引物以寡聚T起始和以随机引物起始得到的标记产物与不同类型芯片的杂交是不同的，对于cDNA芯片，两者都可以采用，而对于寡核苷酸芯片以寡聚T起始的标记产物则需要片段化；又如在cDNA芯片中，可能发生的误差主要来源于同源性基因间的干扰，而对于寡核苷酸芯片其误差主要来源于杂交信号的强度和杂交的稳定性。
数据处理
数据处理是芯片实验的最后步骤也是重要的一个环节。对于所有类型的芯片，其结果数据都是通过一定统计处理后得到的。最初的处理是通过与内参照标准比较对数据进行归一化处理（可以采用多种计算方法）得到一个相对的数值，对于寡核苷酸芯片这一数值就可以用来在不同的芯片结果间进行比较（间接法），而对于CDNA芯片，则需要对每张芯片的结果计算出相对比值（直接法）从而可以在不同芯片结果间进行比较。在大多数的芯片实验中采用两种不同荧光标记产物，由于不同荧光物质的不同特性导致在不同的信号强度范围产生不同的偏差，一般情况下在低信号强度下CY3与CY5相比产生的信号偏高，而在高信号强度下则没有明显偏差，因此对芯片的原始数据还需要进行相应的数据调整特别是对于采用直接法（每张芯片计算出独立的比值）进行的芯片实验。一个科学的数据处理模型对于产生可靠的芯片实验结果是十分重要的，有许多数学统计模型可以用于芯片数据处理，选择一个适当的模型也十分关键。
总结起来，芯片实验设计需要考虑多方面的条件。从成本预算估计可以采用的重复性实验次数；从实验目的出发选择合理的实验材料；从实验材料出发考虑取材方法和芯片实验的具体策略；从芯片实验的类型选择适当的数据处理模型；最后还有针对芯片实验可能的假阳性结果采用其他方法进行进一步的确认。
作为一种高通量的实验平台，基因芯片可以同时对多至上万个基因进行表达水平的监测。考虑到芯片实验本身的高成本，实验前对整个实验方案的认真设计就显得非常重要。影响芯片结果的主要方面包括被检测实验材料本身，芯片实验过程，数据处理过程。
实验材料
实验材料的选用直接影响到最后结果的解释。在选择时要注意以下几点：
1.根据实验需要达到的目的，首先要求实验材料具有代表性，如临床标本的取材部位，病人的临床诊断是否明确，同时要考虑疾病本身的多样性背景等等；
2.其次根据材料的特性选择合适的实验路线，如材料来源的难易，材料的类型（细胞或组织或其它生物类型），对于来源较困难的样品，需要对其进行适当的处理（如体外扩增）；而对于来源充足的样品，则可以直接用于芯片实验而避免体外处理带来的系统性误差；
3.最后是取材过程的控制，基本要求是快速准确，同时注意样品保存条件的合理性。
芯片实验过程
1.首先是芯片实验的重复性要求
一般情况下芯片实验要求有独立的重复性实验以减少假阳性或假阴性结果的产生，但是考虑到实验的成本，也有研究人员采用一次芯片实验的结果作为参照通过其他低成本的方法如RT-PCR，NORTHERN BLOT等方法对感兴趣的结果进行确认；当然如果不存在成本方面的考虑，可以完成更多次的芯片实验以得到统计学上的分析意义，特别是对于临床上复杂疾病的研究，个体的差异性和诊断学上的差异性往往会掩盖或突出某些相关或不相关的基因表达信息，对于多个不同个体和病理类型的筛差可以得到更多与临床诊断相关的信息，许多临床肿瘤学的研究都采用了多样本的芯片实验。
2.其次是选用的芯片类型，如寡核苷酸芯片或cDNA芯片的具体实验操作是有所不同的。
3.如果采用多次的芯片实验，其实验设计又可以分为直接比较和间接比较两种；前者采用不同实验组与不同对照组或同一个对照组直接进行比较，后者则以不同实验组和不同对照组或同一个对照组与同一个参照样品分别比较，最后得出实验组与对照组间的变化关系。
4.不同的实验方法对于实验系统的要求以及引入的系统性误差是不同的。如反转录引物以寡聚T起始和以随机引物起始得到的标记产物与不同类型芯片的杂交是不同的，对于cDNA芯片，两者都可以采用，而对于寡核苷酸芯片以寡聚T起始的标记产物则需要片段化；又如在cDNA芯片中，可能发生的误差主要来源于同源性基因间的干扰，而对于寡核苷酸芯片其误差主要来源于杂交信号的强度和杂交的稳定性。
数据处理
数据处理是芯片实验的最后步骤也是重要的一个环节。对于所有类型的芯片，其结果数据都是通过一定统计处理后得到的。最初的处理是通过与内参照标准比较对数据进行归一化处理（可以采用多种计算方法）得到一个相对的数值，对于寡核苷酸芯片这一数值就可以用来在不同的芯片结果间进行比较（间接法），而对于CDNA芯片，则需要对每张芯片的结果计算出相对比值（直接法）从而可以在不同芯片结果间进行比较。在大多数的芯片实验中采用两种不同荧光标记产物，由于不同荧光物质的不同特性导致在不同的信号强度范围产生不同的偏差，一般情况下在低信号强度下CY3与CY5相比产生的信号偏高，而在高信号强度下则没有明显偏差，因此对芯片的原始数据还需要进行相应的数据调整特别是对于采用直接法（每张芯片计算出独立的比值）进行的芯片实验。一个科学的数据处理模型对于产生可靠的芯片实验结果是十分重要的，有许多数学统计模型可以用于芯片数据处理，选择一个适当的模型也十分关键。
总结起来，芯片实验设计需要考虑多方面的条件。从成本预算估计可以采用的重复性实验次数；从实验目的出发选择合理的实验材料；从实验材料出发考虑取材方法和芯片实验的具体策略；从芯片实验的类型选择适当的数据处理模型；最后还有针对芯片实验可能的假阳性结果采用其他方法进行进一步的确认。
