基因芯片的制作

基因芯片的制作，是基因芯片上固定的探针主要包括cDNA、寡核苷酸两种类型，这些探针固化于芯片上形成基因探针的微集阵列。

基因芯片的制作的基本原理是：

一是核酸的原位合成；二是将事先制备好的基因探针有序地固化于支持物表面。通过采用显微光蚀刻（照相平板印刷）、压电打印、分子印章等技术，在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片，代表性的芯片包括 Affymetrix公司的GeneChip产品系列等。

另一种更常见的制备方式是在芯片以外，采用常规分子生物学技术如基因克隆与PCR扩增、人工合成寡核苷酸等，预先制备cDNA或合成寡核苷酸探针，然后通过精密的自动化机械打印系统，将探针点样或打印到包被的固相支持物（或称载体）上的一个较小的区域，然后再固定在支持物上。

基因芯片的制作的基本过程可分为如下几步：

（一）探针的设计与制备

DNA微阵列的探针可采用人工合成的核苷酸片段，或从基因组中制备的、较长的基因片段或cDNA。可根据实验设计从上述几种类型中进行选择，如进行基因突变检测时可采用寡核苷酸探针制作芯片；基因表达谱分析时可采用cDNA芯片或50-70个碱基的长链寡核苷酸芯片。

注意事项：书中未体现

（二）支持物的类型与预处理

用于DNA芯片制作的固相支持物有实性材料和膜性材料两类。实性材料包括硅芯片、玻片和工程瓷片等；膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。目前最常用的支持物是玻片。打印前需要对支持物进行表面化学处理，使支持物表面上衍生出氨基、醛基或羟基等功能基团以连接探针，并使探针稳定地固化于支持物表面，以防止在杂交时被洗脱。

支持物表面经处理后，可减少亲水性的探针在其表面的扩散，提高点阵的打印密度。玻片的预处理方法包括采用多聚赖氨酸或氨基硅烧包被的氨基化处理，以及醛基化处理等。

注意事项：书中未体现

（三）探针的打印

目前DNA微阵列的打印多采用针式打印。这种方式是通过不锈钢打印针与支持物表面的接触来完成液滴的转移，故又称为接触式打印。预先制备好的探针溶液常放置在96孔或384孔板上，打印针浸入探针溶液，吸取一定量的液体，移至支持物上方，然后打印针垂直运动触及支待物表面后留下液滴，或采用电压控制的喷墨机制进行显微打印，随后清洗打印针，真空干燥后进行下一个位点的打印。也可用多针同时进行打印。

注意事项：书中未体现

（四）探针的固化

在支持物上打印探针后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定。其中氨基修饰的玻片常可通过紫外线交联法，即以一定能量的紫外线进行照射，使DNA探针中的胸腺晓唗残基与支持物上带正电的氨基形成共价键而固定探针。

醛基修饰的玻片则可通过希夫碱连接法，即氨基末端修饰探针的氨基与玻片上的醛基形成希夫碱来实现探针的固化。