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基因芯片使用的基本流程

相关实验:基因芯片技术

最新修订时间:

简介

基因芯片是具有高效、灵敏、高通量、平行化等特点,可对来源于不同个体(正常人与患者)、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激(诱导、治疗条件)下细胞内的mRNA或cDNA进行大规模平行检测与分析。

原理

基因芯片的基本原理是是一种大规模集成的固相杂交(反向点杂交),核酸分子杂交,即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针,检测样品中哪些核酸序列与其互补,然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因信息,图解示意【16-3】。

材料与仪器

器材:

PCR反机器、金属浴、真空干燥机器、玻璃纤维过滤柱

杂交盒、离心机、水浴锅、摇床、盖玻片。

试剂:

①RNA、DEPC-H2O、Oligo (dT)12-18

②5x 反转录缓冲液60 µl,5 mmol/L DTT 60 µl, 5 mmol/L DTT 60 µl,100 µmol/L dATP 、dCTP、dGTP 各1.5 µl, 100 mmol/L dTTP 0.3 µl,DEPC-H20 175.2 µl

③Cy3-/ Cy5-dUTP (1 mmol/ L) 、Superscript™ II 反转录酶 (200 U/µl )、pH8.0的TE洗脱、NaOH(500 mmol/L)、HCl(500 mmol/L)

④去离子甲酰胺、1% 牛血清白蛋白、人Cot1-DNA或polyA-DNA(20 µg/µl)溶液

⑤预杂交液(5 x SSC 0.1% SDS和1% BSA)、异丙醇、Cy3-和Cy5-标记探针

⑥2X杂交缓冲液(50% 甲酰胺、10 x SSC、0.2% SDS)、蒸馏水

⑦无水乙醇

步骤

基因芯片使用的基本过程可分为如下几步:

(一)样品准备

采用常规方法从组织细胞中分离纯化样品核酸,再对待测样品中的靶DNA进行特异性扩增,并在扩增过程中进行标记。基因表达谱芯片的样品标记常采用反转录标记法,即在反转录过程中掺入标记物。

A 在离心管中加入:

10 µg 总 RNA( 或 2 µgmRNA)
2 µg Oligo (dT)12-18

加 DEPC-H2O 至总体积 10 µl。

B 将上述混合液于 70 ℃加热10 min, 迅速置冰上冷却1 min 。

C 加入:

标记反应混合液 15 µl
Cy3-/ Cy5-dUTP (1 mmol/ L) 3 µl

Superscript™ II 反转录酶 (200 U/µl ) 2 µl

D. 混匀,42 ℃保温 2 h 。

E.反转录标记反应完成以后,将样品离心到管底,加入1.5 ul EDTA(20 mmol/L)终止反应。

F.加1.5 ul NaOH(500 mmol/L),70 ℃加热10分钟降解RNA。

G.加1.5 ul HCl(500 mmol/L)中和NaOH。

H.用玻璃纤维过滤柱除去没有标记上的荧光核苷酸;用50 ul(pH8.0)的TE洗脱纯化产物,并真空干燥;将标记探针溶于10 ul DEPC处理的H2O中。

(二)杂交反应与杂交后清洗

与常规的分子杂交过程基本相似,先预杂交,再加入含有靶基因的杂交液杂交3-24小时或以上,然后洗脱、干燥,以待检测。基因表达谱芯片杂交时,需要较长的时间(往往要求杂交过夜),需要高盐浓度、高的样品浓度、较低的杂交温度,但严谨性要求较低,这有利于提高检测的特异性、保证较高的灵敏度并可检测出低拷贝的基因。

杂交后的芯片要经过严谨条件下的洗涤,洗去未杂交的一切残留物。杂交和洗脱的条件都必须通过实验进行优化以保证特异性。

A.准备好去离子甲酰胺、1% 牛血清白蛋白、人Cot1-DNA或polyA-DNA(20 µg/µl)溶液和杂交盒。

B.将制备好的芯片浸入预杂交液(5 x SSC 0.1% SDS和1% BSA)内,42 ℃温育45 min,用去离子水室温下清洗5次,在异丙醇中浸一下,空气干燥。

C.取纯化的Cy3-和Cy5-标记探针各10 µl,昆合,然后加入1 µl Cot1-DNA(20 µg/µl),1 µl polyA-DNA(20 µg/µl),混匀后95 ℃变性5 min,最大转速离心1 min。

D.将样品与等体积、42 ℃预热的2X杂交缓冲液(50% 甲酰胺、10xSSC、0.2% SDS)混合,然后加到预杂交处理过的芯片上,小心地盖上盖玻片,以防产生气泡。

E.放入杂交盒,并在其两端的小孔中各加入10 µl水保持湿度。42 ℃ 水浴杂交16-20 h。

F,打开杂交盒,轻轻取出芯片,不要移动盖玻片。将芯片迅速浸入洗液1中,42 ℃轻轻摇晃4 min。

G,将芯片转移至洗液2中,室温下轻轻摇晃4 min;将芯片转移至洗液3中,洗脱1 min,重复4次。

H.用蒸馏水冲冼玻片,用无水乙醇清洗小于10 s,空气干燥。

(二)扫描分析

芯片杂交及清洗后,带有荧光标记的靶DNA与其互补的DNA探针形成杂交复合物,在激光激发下,荧光分子发射荧光。以基因芯片扫描仪对荧光信号进行检测、分析,得到芯片杂交图像的同时,探针的荧光信号强度也用具体数值反映出来。

在得到原始数据后,必须对微阵列上探针的荧光强度进行标准化处理、分析才能鉴定出差异表达的基因。标准化就是校正荧光标记物的标记效率和检测效率之间的差异。

这些差异可导致Cy5和Cy3平均比值的波动,因此在分析前就必须对荧光强度进行校正。进一步可根据标准化后的探针的荧光信号强度,来筛选差异表达基因。

由于在杂交过程中标记了Cy3和Cy5的样品与探针发生竞争性杂交,探针同时结合了两个样品中碱基序列互补的核酸片段,因此芯片上每一个探针都同时显示出Cy3和Cy5的两种荧光信号.

可以根据其Cy3和Cy5的比值(Ratio值)来鉴定差异表达基因:Cy3与Cy5的比值(Cy3/Cy5)在0.5-2.0范围内的基因不存在显著的表达差异,而比值>2或<0.5,则认为该基因的表达出现显著改变(即为差异表达基因)。

来源:丁香实验

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