基因芯片使用的基本流程

基因芯片是具有高效、灵敏、高通量、平行化等特点，可对来源于不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（诱导、治疗条件）下细胞内的mRNA或cDNA进行大规模平行检测与分析。

基因芯片的基本原理是是一种大规模集成的固相杂交（反向点杂交），核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因信息，图解示意【16-3】。

PCR反机器、金属浴、真空干燥机器、玻璃纤维过滤柱

杂交盒、离心机、水浴锅、摇床、盖玻片。

①RNA、DEPC-H₂O、Oligo (dT)12-18

②5x 反转录缓冲液60 µl，5 mmol/L DTT 60 µl， 5 mmol/L DTT 60 µl，100 µmol/L dATP 、dCTP、dGTP 各1.5 µl, 100 mmol/L dTTP 0.3 µl,DEPC-H20 175.2 µl

③Cy3-/ Cy5-dUTP (1 mmol/ L) 、Superscript™ II 反转录酶 (200 U/µl )、pH8.0的TE洗脱、NaOH(500 mmol/L)、HCl(500 mmol/L)

④去离子甲酰胺、1% 牛血清白蛋白、人Cot1-DNA或polyA-DNA(20 µg/µl)溶液

⑤预杂交液(5 x SSC 0.1% SDS和1% BSA)、异丙醇、Cy3-和Cy5-标记探针

⑥2X杂交缓冲液(50% 甲酰胺、10 x SSC、0.2% SDS)、蒸馏水

基因芯片使用的基本过程可分为如下几步：

采用常规方法从组织细胞中分离纯化样品核酸，再对待测样品中的靶DNA进行特异性扩增，并在扩增过程中进行标记。基因表达谱芯片的样品标记常采用反转录标记法，即在反转录过程中掺入标记物。

A 在离心管中加入：

加 DEPC-H₂O 至总体积 10 µl。

B 将上述混合液于 70 ℃加热10 min, 迅速置冰上冷却1 min 。

C 加入：

Superscript™ II 反转录酶 (200 U/µl ) 2 µl

D. 混匀，42 ℃保温 2 h 。

E.反转录标记反应完成以后，将样品离心到管底，加入1.5 ul EDTA（20 mmol/L）终止反应。

F.加1.5 ul NaOH(500 mmol/L)，70 ℃加热10分钟降解RNA。

G.加1.5 ul HCl(500 mmol/L)中和NaOH。

H.用玻璃纤维过滤柱除去没有标记上的荧光核苷酸；用50 ul（pH8.0）的TE洗脱纯化产物，并真空干燥；将标记探针溶于10 ul DEPC处理的H₂O中。

（二）杂交反应与杂交后清洗

与常规的分子杂交过程基本相似，先预杂交，再加入含有靶基因的杂交液杂交3-24小时或以上，然后洗脱、干燥，以待检测。基因表达谱芯片杂交时，需要较长的时间（往往要求杂交过夜），需要高盐浓度、高的样品浓度、较低的杂交温度，但严谨性要求较低，这有利于提高检测的特异性、保证较高的灵敏度并可检测出低拷贝的基因。

杂交后的芯片要经过严谨条件下的洗涤，洗去未杂交的一切残留物。杂交和洗脱的条件都必须通过实验进行优化以保证特异性。

A.准备好去离子甲酰胺、1% 牛血清白蛋白、人Cot1-DNA或polyA-DNA(20 µg/µl)溶液和杂交盒。

B.将制备好的芯片浸入预杂交液(5 x SSC 0.1% SDS和1% BSA)内，42 ℃温育45 min，用去离子水室温下清洗5次，在异丙醇中浸一下，空气干燥。

C.取纯化的Cy3-和Cy5-标记探针各10 µl，昆合，然后加入1 µl Cot1-DNA(20 µg/µl)，1 µl polyA-DNA(20 µg/µl),混匀后95 ℃变性5 min,最大转速离心1 min。

D.将样品与等体积、42 ℃预热的2X杂交缓冲液(50% 甲酰胺、10xSSC、0.2% SDS)混合，然后加到预杂交处理过的芯片上，小心地盖上盖玻片，以防产生气泡。

E.放入杂交盒，并在其两端的小孔中各加入10 µl水保持湿度。42 ℃ 水浴杂交16-20 h。

F,打开杂交盒，轻轻取出芯片，不要移动盖玻片。将芯片迅速浸入洗液1中，42 ℃轻轻摇晃4 min。

G,将芯片转移至洗液2中，室温下轻轻摇晃4 min;将芯片转移至洗液3中，洗脱1 min,重复4次。

（二）扫描分析

芯片杂交及清洗后，带有荧光标记的靶DNA与其互补的DNA探针形成杂交复合物，在激光激发下，荧光分子发射荧光。以基因芯片扫描仪对荧光信号进行检测、分析，得到芯片杂交图像的同时，探针的荧光信号强度也用具体数值反映出来。

在得到原始数据后，必须对微阵列上探针的荧光强度进行标准化处理、分析才能鉴定出差异表达的基因。标准化就是校正荧光标记物的标记效率和检测效率之间的差异。

这些差异可导致Cy5和Cy3平均比值的波动，因此在分析前就必须对荧光强度进行校正。进一步可根据标准化后的探针的荧光信号强度，来筛选差异表达基因。

由于在杂交过程中标记了Cy3和Cy5的样品与探针发生竞争性杂交，探针同时结合了两个样品中碱基序列互补的核酸片段，因此芯片上每一个探针都同时显示出Cy3和Cy5的两种荧光信号.

可以根据其Cy3和Cy5的比值(Ratio值）来鉴定差异表达基因：Cy3与Cy5的比值(Cy3/Cy5)在0.5-2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而比值＞2或＜0.5,则认为该基因的表达出现显著改变（即为差异表达基因）。