基因芯片的必备知识和操作流程

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基因芯片 技术的诞生为生物技术工作人员打开了一道科研的便利之门，曾被评为1998年年度十大科技进展之一。本文对基因芯片的实验原理、技术基础、分类、用途、操作主要环节等内容做详细的介绍。

1.基本原理和技术基础

基因芯片以DNA杂交 为基本原理，基于A和T、G和C的互补关系。它是在探针的基础上研制出的。所谓探针是一段人工合成或筛选出的已知顺序的碱基序列，样品分子上连接有一些cy3、cy5等可检测的物质。

经激光共聚焦荧光显微镜检出杂交或反应信号，通过计算机处理、分析，即可获得所需信息。例如，用红、绿荧光分别标记实验样本和对照样本的cDNA，混合后与微阵列杂交，可显示实验样本和对照样本基因的表达强度(显示红色、绿色或黄色)，由此可在同一微阵列上同时检测两样本的基因表达差异。

在基因芯片工作过程中，固定位点使用不同分子生物学技术和碱基互补配对原则与待测基因片段杂交，并通过自动阅读设备分析杂交结果，达到定性、定量分析的目的。

基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。

基因芯片的检测主要建立在放射标记技术、荧光 标记技术、质谱分析、化学发光等技术上。使用荧光标记的基因芯片需要专用的荧光扫描仪。对于高密度的基因芯片，目前最常用的是激光共聚焦显微镜和高性能的冷却CCD。

目前专用于荧光扫描的扫描仪大致分为两类：一类是基于CCD(charge-coupled device，电荷耦合装置)的检测光子;另一类则是基于PMT(photomultiplier tube，光电倍增管)的检测系统。

生物芯片的发展得益于微细加工技术和现代分子生物技术的结合。随着人类基因组计划的实施，现代分子生物技术也取得了巨大突破：体外基因扩增技术实现了核酸样品的快速制备和放大，基因扩增后可进行基因测序，而基因探针技术使得基因测序的检测自动化成为可能，极大地促使了生物芯片的发展。

微阵列的加工借助的是微电子工业中应用十分成熟的光学光刻技术和微机电系统加工中所采用的各种方法，根据要求在玻璃、塑料、硅片等基底材料上加工出用于生物样品分离、反应的各种微细结构，然后在微结构上施加表面化学处理。

光学光刻的第一步是通过光学制板照相制备掩模。制备好的掩模通常是镀有铬层的石英玻璃板，该铬层事先已按微细结构的图形被刻蚀成透光和不透光两个部分。第二步是光刻，让掩模与表面涂有光刻胶的硅片接触，然后让光源通过掩模照射到硅片上。

通过显影光刻胶中的图形，使其上未被掩模遮掩的部分被溶解除去。上述工作完成之后，通过对无胶保护的硅片用腐蚀剂蚀刻，再去除剩余的光刻胶便可获得所需生物芯片的微细结构。

微米级甚至纳米级的微细加工技术使得数以万计的生物探针(DNA片段、抗原和抗体)等微观结构成功地排列在很小的芯片载体上，从而保证了生物芯片检测的集成化、微型化和高通量化。

2.基因芯片的分类

基因芯片是分子生物学和微细加工技术(micro fabrication technology)相结合的产物，分类方法有多种。分类的依据主要有制作方法、载体材料、载体上所固定的DNA的种类、用途等。

1)根据制作方法，可将基因芯片分为原位合成芯片与合成后点样芯片(王升启等，1999)。前者利用光引导聚合技术(1ight-directed synthesis)或压电打印法(piezoelec-tric printing)进行原位合成寡聚核苷酸探针，以美国Affymetrix公司的芯片产品为代表;后者主要利用微型机械点样法或化学喷射法将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器直接点在芯片片基上。

2)根据芯片上固定的探针数量，可以将基因芯片分为高密度芯片和中低密度芯片两类。高密度芯片上的探针数量从几万到上百万，主要是通过原位合成制备的寡核苷酸芯片，以及通过将数万个基因或者EST序列的PCR扩增产物直接点至芯片上制备的cDNA芯片。

高密度基因芯片主要用于大规模的基因表达谱测定、药物筛选和新药开发、基因功能探索等方面。中低密度芯片中探针的数目一般在几十到几千不等，一般是通过合成后点样制备的芯片，主要用于基因突变分析、基因表达谱分析等领域。

基因芯片的主要特点是高通量。实际上中低密度芯片是基因芯片在临床应用上的发展趋势，原因主要是以下两点：

①尽管多数疾病的影响因素很多，但是在诊断和鉴别中的目的是具体的，所以检测需要低通量的;

②中低密度芯片检测的指标较少，各指标问的相互影响作用较小，在制作工艺和检测结果上更能保证准确性。

3)根据芯片上探针的不同，可将基因芯片分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。

①寡核苷酸芯片：用照相平版印刷术(photolithography)和固相合成术结合在基片上生成寡核苷酸，由Fodor首先在1991年报道。该技术是先在玻片上涂上光敏化学材料，盖上罩，根据所要合成的碱基序列决定罩的透光位点。

光照局部产生去防护作用，用所需核苷酸冲洗玻片，该核苷酸即在去防护部位粘合于玻片。核苷酸的5'端修饰以光不稳定的保护基团，该基团经光照而去保护，与下一个核苷酸结合。如此重复直至获得所需核苷酸长度。

每一层各点的A、T、C、G不同，故每合成一层核苷酸需要4个不同透光位点的罩和A、T、C、G分别冲洗一次。通过4×n次步骤可合成含有n个核苷酸的寡核苷酸链。其主要特点是可按需要设计一定序列的寡核苷酸链。美国的Affymetrix公司已能生产40万个寡核苷酸/1.6cm2的芯片。

②cDNA 芯片：将特定的或文库的cD-NA经PCR扩增后用机械手点到基片上。最先由Schena于1995年报道。美国Synteni公司的cDNA微阵列已达10^4cDNA/3.6cm^2。

4)根据芯片用途，可以将芯片分为基因表达谱芯片、测序芯片、诊断芯片等。基因表达谱芯片技术是一种领先的研究方法。例如，通过对人类基因组中成千上万个基因的表达水平进行高通量检测来寻找具有差异的基因表达，从而预测个体患者的病程发展及治疗效果，以最终实现疾病的个体化治疗。

DNA测序芯片则是基于杂交测序发展起来的，其原理是任何线状的单链DNA或者RNA序列均可以分解成一系列碱基数固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称为亚序列，如果能把原序列所有的错落重叠的亚序列全部测出，就可以据此组建出原序列。

5)根据载体材料不同，可将基因芯片分为尼龙膜、玻璃片、塑料片、硅胶晶片、微型磁珠等。

3.基因芯片的主要技术环节

基因芯片技术能够提供极为丰富的信息，但其操作流程并不复杂。应用基因芯片进行实验的操作过程主要包括以下4个环节。其基本要点为：芯片方阵的构建、样品的制备、杂交反应和信号的检测及分析。

1.方阵的构建

1)探针的制备。芯片的类型不同，制备探针的方法也不尽相同。如果是检测表达谱，需要从待检测样品mRNA或者总RNA中制备cDNA探针;如果是SNP检测，则需要从待检测样品DNA中通过PCR制备探针或者人工合成寡核苷酸探针。

2)片基处理。目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合分类化学的方法来处理片基，然后使DNA片段按顺序排列在芯片上。经特殊处理过的玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硅胶晶等都可作为载体材料。探针的固定化方法目前常用两种：寡聚赖氨酸法、醛基一氨基法，其他方法(如巯基一双硫键法)也在研究中。固定化的效率也不同。

3)点样。因芯片种类较多，点样方法也不尽相同，但基本上可分为原位合成与微矩阵点样两大类。

①原位合成是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法，具体又可分为光引导原位合成、喷墨打印和分子印迹原位合成三种方法。

这三种技术所依据的固相合成原理相似，只是在合成前体试剂定位方面采取了不同的解决办法，由于原位合成的短核酸探针阵列具有密度高、杂交速度快、效率高等优点，而且杂交效率受错配碱基的影响很明显，所以原位合成的DNA微点阵适合于进行突变检测、多态性分析、表达谱检测、杂交测序等需要大量探针和高的杂交严谨性的实验。

②微矩阵点样法是将PCR等得到的。DNA或生物分子用针点或喷射的方法直接排列到载体上。该方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于芯片载体上。

2.样品的制备

生物样品是复杂的生物分子混合体，一般不能直接与芯片反应，必须将样品进行生物处理。对于基因芯片，组织中获取的DNA/mRNA样品必须通过扩增(PCR)以提高检测的灵敏度。

1)细菌性样本。检测的对象如果是细菌性样本，在必要的情况下，首先应该进行增菌处理，然后使用合适的方法提取样本中的DNA，设计特异或通用的引物进行PCR扩增，使样品分子标记上可以检测的荧光分子。

美国Mosaic技术公司发展的一种固相PCR系统包含两套引物，每套引物都可从靶基因两头延伸(Chang et a1.，2004)。当引物和DNA样品及PCR试剂相混时，如果样品包含靶序列，DNA就从引物两头开始合成，并在引物之间形成双链DNA环。由于上述反应在固相中产生，避免了引物竞争现象，并可减少残留物污染和重复引发。

2)病毒性样本。如果待检样本是病毒，DNA病毒的操作过程与细菌性样本的操作过程相似，而RNA病毒则需要加入一个RT-PCR过程。目前，已有多种PCR方法广泛使用，目的是提高扩增效率和特异性，如TouchDown PCR、巢式PCR、长距离PCR等。

3.杂交反应

样品与芯片的杂交反应中涉及的因素主要有杂交温度、杂交时间、杂交液的成分等。生物分子反应是生物芯片技术中除方阵构建外最重要的一步，其复杂的程度和具体控制条件由芯片中基因片段的长短和芯片本身的用途而定。

如果是基因表达检测，反应时需要高盐浓度、低温和长时间。如果要检测是否有突变，因涉及单个碱基的错配，故需要在短时间内、低盐、高温条件下高特异性杂交。

4.信号的检测和分析

信号检测与分析即对生化反应所得结果的分析测定。基因芯片在与荧光标记的目标DNA或RNA杂交后，必须用激光共聚焦扫描芯片和CCD芯片扫描仪将芯片测定结果转变成可供分析处理的图像数据，此方法重复性好，但是灵敏度相对较低。

目前正在研究的替代方法有质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等。生物芯片还需一个专门的系统来处理芯片数据，一个完整的芯片数据处理系统应该包括芯片图像分析和数据提取以及芯片数据的统计学分析和生物学分析，另外还要做芯片的数据库管理、芯片表达基因的国际互联网上检索。

基因芯片这个词听起来挺高深的，不过实验操作流程却不复杂。需要注意的是，由于芯片的类型不同，探针的制备方法也会有所差异。了解更多基因芯片相关软件、知识点、公司品牌等可移步生物帮DNA芯片专题 。