【转帖】不用试剂盒的凝胶回收（来自网络）
丁香园论坛
3027
不用试剂盒的凝胶回收（来自网络） 2008-01-09 15:41:32| 分类： 分子生物学实验室 | 标签： |字号大中小 订阅 .
（1）用小针头在0.5ml离心管底部打洞，用玻璃棉塞住离心管底部。
（2）紫外透射检测仪下观察，用小刀片小心切出含有目的片段的凝胶。
（3）将凝胶条放入0.5ml离心管中，外套1.5ml离心管，8000rpm离心3分钟。用微量取液器吸取1.5ml离心管中的液体，转移到另一干净的1.5ml离心管中。然后重复离心，直到将凝胶条中的液体全部转移为止。
（4）用等体积酚/氯仿抽提。重复二次。
（5）加入0.1倍体积3M醋酸钠及2.5倍体积无水乙醇。然后置-20℃冰箱30min。
（6）4℃条件下，15000rpm离心15min，弃上清液。
（7）75%乙醇清洗沉淀，15000rpm离心5min，弃上清液
（8）风干沉淀，15微升ddH2O溶解
胶回收的心得体会
1. 提高胶回收量的办法：
1) 增加电泳时的上样量。
2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。
3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。
4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。
5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。
6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。
8) 最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。
9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。
10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。
2. 几种PCR 产物回收的详方法和步骤
1) 普通胶回收
如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚。
2) 从低熔点凝胶回收DNA
纯化Dundefined*段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。
3) 扩增特异性好的PCR回收
如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。
3. 不需胶回收就可直接连接的方法
1) 低温冷冻析出法
跑电泳时用低熔点的agarose胶，跑到一定时候，将目的条带所在的那一段胶切下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的表面，并且，把底下没有脱氧核酸的那点胶也尽量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在负75度冰箱中10－30分钟，接着1，300rpm离心5－10分钟，取10ul上清，加入连接体系中。将其余的液体也吸出，储存在另一个管子中，做好标记，放在－20度备用。
2) 酶切后的直接连接
在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好的片断的
.
1.琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液，保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中（如果用柱子的话）。对于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%异丙醇。
2.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。当然你要将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用X片，未标记的用EB。
3.选用回收效率较高的柱子，比如进口的Qiaquick spin column。
4.参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收Dundefined*段。
（1）用小针头在0.5ml离心管底部打洞，用玻璃棉塞住离心管底部。
（2）紫外透射检测仪下观察，用小刀片小心切出含有目的片段的凝胶。
（3）将凝胶条放入0.5ml离心管中，外套1.5ml离心管，8000rpm离心3分钟。用微量取液器吸取1.5ml离心管中的液体，转移到另一干净的1.5ml离心管中。然后重复离心，直到将凝胶条中的液体全部转移为止。
（4）用等体积酚/氯仿抽提。重复二次。
（5）加入0.1倍体积3M醋酸钠及2.5倍体积无水乙醇。然后置-20℃冰箱30min。
（6）4℃条件下，15000rpm离心15min，弃上清液。
（7）75%乙醇清洗沉淀，15000rpm离心5min，弃上清液
（8）风干沉淀，15微升ddH2O溶解
胶回收的心得体会
1. 提高胶回收量的办法：
1) 增加电泳时的上样量。
2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。
3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。
4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。
5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。
6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。
8) 最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。
9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。
10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。
2. 几种PCR 产物回收的详方法和步骤
1) 普通胶回收
如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚。
2) 从低熔点凝胶回收DNA
纯化Dundefined*段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。
3) 扩增特异性好的PCR回收
如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。
3. 不需胶回收就可直接连接的方法
1) 低温冷冻析出法
跑电泳时用低熔点的agarose胶，跑到一定时候，将目的条带所在的那一段胶切下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的表面，并且，把底下没有脱氧核酸的那点胶也尽量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在负75度冰箱中10－30分钟，接着1，300rpm离心5－10分钟，取10ul上清，加入连接体系中。将其余的液体也吸出，储存在另一个管子中，做好标记，放在－20度备用。
2) 酶切后的直接连接
在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好的片断的
.
1.琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液，保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中（如果用柱子的话）。对于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%异丙醇。
2.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。当然你要将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用X片，未标记的用EB。
3.选用回收效率较高的柱子，比如进口的Qiaquick spin column。
4.参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收Dundefined*段。
