片段凝胶回收:试剂盒回收(离心法)
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1、在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小。计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积(如如100mg=100ul)。
2、根据凝胶的浓度,加DE-A 液
凝胶浓度 DE-A溶液体积
≤1.0% 3个凝胶体积
≤1.5% 4 个凝胶体积
≤2.0% 5 个凝胶体积
混匀后于75℃加热,(低熔点琼脂糖凝胶于45oC加热),间断混合,直到凝胶熔化(6-8分钟)。
3、加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀(是否需调整PH值,见注意事项1);当分离的DNA片段小与400bp 时,加入异丙醇至终浓度为
4、吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟。如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液
5、将制备管置回离心管,加0.5ml W1溶液,3600rpm离心30,弃滤液
6、将制备管置回离心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次; (W2中含有酒精,应保证瓶子密封。)
7、将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟
8、将制备管置洁净的1.5 ml 离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置1分钟。最高速度离心1分钟洗脱
注意事项
1、此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,溶液的PH要调整到6.5以下
2、勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解。勿将凝胶长时间暴露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤
3、步骤中的凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率
4、步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率。将洗脱液或水加热到60℃,可提高回收效率。(重要)
5、分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。(试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某种抑制作用。)