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常规片段的琼脂糖凝胶回收

互联网

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常规片断级的选择指南: 所谓常规级,即回收片段大小介于100bp和10kb之间,在这个范畴内包含了一般的质粒或者克隆片段的回收。主流方法是柱回收试剂盒。

1. Qiaquick Gel Extraction Kit

品牌:Qiagen

回收范围:70bp-10kb

特点:

高达80%回收率

操作快速简单,3步完成70bp-10kb片段的回收

提供三色指示剂的电泳上样loading Buffer,方便判断和操作

回收产物纯度高,可用于同位素或荧光测序、芯片分析、连接转化、酶切、标记、PCR、显微注射、体外转录等后继实验

使用心得:

Qiaquick最引以为傲的就是非常稳定的质量,高回收率和方便的步骤。

产品质量的稳定可靠,一向是实验首要条件。毕竟,实验步骤是环环相扣的,每一步出现问题都会导致后患无穷,费时费力,还更费钱,对心情更是一种折磨。

用试剂盒不就图省事和可靠吗?从核酸纯化领域起步的Qiagen,在全球实验室都享有极好的口碑,是值得信赖的选择。

因为Qiagen有强大的研发队伍,精益求精优化实验操作的每一环节,绝非普通临摹制品、仿制品可比。

以回收率为例,我们前面提到,由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响,所以回收率并非是一成不变的。所以Qiagen以严谨的态度提供多种条件下的详细介绍:

使用QIAquick回收之前和回收之后再混合的DNA 片段 (大小已指出) 。对所有尺寸的片段均获得了接近80%的回收率。

A 1-5 : 回收之前; P : 回收之后再混合。样品使用 1.5% 琼脂糖凝胶分析(TAE buffer)。

B 1-3: 回收之前; P : 回收之后混合。样品于 3.5% 高分辨琼脂糖凝胶上分析( TAE buffer)。M : pTZ-HinfI marker。

记得《分子克隆II》里曾经说少于500ng的DNA 几乎没有回收价值,看看上表就可以发现,现在的技术发展,即使是少到100ng的DNA 还有70%的回收率呢!而且操作方法还很简单。


虽然是几乎不需要实验技巧的简单操作,如果你注意到一些小技巧 还是很有帮助的。DNA 回收纯度取决于纯化介质对DNA 吸附的特异性、洗涤杂质是否彻底。而DNA 回收率和浓度则与elution buffer的体积,以及buffer在柱子上停留的时间有关。较大的洗脱体积可以提高回收率,充分洗脱,但是会造成产物浓度太低不好用。比如100-200ul的洗脱液可以彻底洗脱纯化柱吸附的DNA ,不过考虑到后继实验的方便,Qiaquick建议使用50ul的洗涤液,正对加入膜中央(避免加在管壁上而不能充分接触纯化介质),可以完全浸润回收柱上的纯化膜。最低建议采用30ul洗脱液,但是可能会降低回收率。有人试过用15―25ul洗脱2次,觉得这样第一次浓度高第二次比较充分,其实没有必要,只要适当延长在柱上停留的时间,就有助于提高得率――Qiagen的Protocol说明,30ul停留1分钟要比50ul停留1分钟回收浓度高1.7倍。充分离心(保证速度和时间)有助于提高得率和纯度,减少残留对后继实验的影响(这个方法要注意不是所有试剂盒都可以使用,因为有些试剂盒的纯化柱填料松一些,离心有时可能导致少量填料脱落,而Qiagen的这个产品是膜式的,结合非常牢固,中大有人用这个柱子高温消毒后重复使用,效果不赖,可见皮实。当然这是厂家绝对不推荐的)。

其他的技巧也是大家熟知的,比如切胶的时候要尽量减少切胶体积(不超过400mg),由于Qiaquick柱子的载量达到10ug,如果胶块实在太大而预期DNA 总量不超过10ug,可以用大一点的管溶解,分几次上柱离心吸附后再洗涤。注意的是紫外照射时间不要太长,因为紫外线对DNA (特别是对于较大的片段)有影响。还有就是溶胶要彻底,用枪头把胶块弄碎一点有助于50度下快速溶解。溶解完全后溶液的颜色指示溶液的pH值,如果变色需要调pH值以防止实验失败。需要用ddH2O或者TE洗脱的,注意pH在7.0―8.5之间的回收率最高。回收率和片断大小、多少有关,较大的片断(7kb以上)回收率会有所降低,洗脱液预热到50度再加入纯化柱膜中央,有助于提高产率。

除了比较适合个人使用的传统离心式,Qiagen还提供抽滤式的胶回收试剂盒,用抽滤的方法替代离心,使得实验可以连续进行,特别适合批量进行的需要――想象看,你只要将溶胶液加入装配好的抽滤管中,哗一下就抽干了,再加洗涤的试剂,哗一下又好了,多快呀!节约很多时间和功夫,不需要在离心机前面拿进拿出。以后的全自动操作模式就是这样的啦!

看到这里可能大家都会说Qiagen的东西好是好,但是就是贵,一般的实验室都舍不得平时用,往往留着关键时刻做,不错,好东西自然不便宜,不过他们有时候也会打折促销。

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