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大片段DNA的琼脂糖凝胶回收

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大片段:指的是片段大小超过10kb的DNA 片断,由于越长的DNA 分子和纯化膜的结合力越强,洗脱力越差,在离心过柱时可能被“扯断”,因此常规的离心过柱的方法并不适合大片段DNA 的回收。在凝胶电泳的大片断回收,特别是几十kb的大片断,经典方法是电洗脱。

此外,低熔点琼脂糖和琼脂糖酶消化也是常常有人选用的方法,新兴的方法是用玻璃奶或者纯化填料。其实无论用什么方法,在回收大片断时一定要牢记你对付的是大片断,操作时一定要小心注意,粗暴的操作,最后结果也是自己来承受的。

这些方法中,速度最快的就是玻璃奶或者纯化填料珠的试剂盒了。毕竟,谁愿意为一个小小的胶回收浪费2个多小时呢?有那功夫干点别的不好?我最早用的其实是当时的Pharmacia(后来改为Amersham,现在是GE Healthcare Life Sciences)的一个玻璃奶(Glassmilk)试剂盒。

现在记得Glassmilk的人应该不多了,在当时却是我们眼中的神奇宝贝――半个多小时就可以完成本来要搞2个多小时的活:溶胶液溶胶后,加入10ul混匀的玻璃奶溶液,混匀静置吸附后,离心去上清,再清洗1―2次,干燥,最后用洗脱液洗脱,离心取上清即可。

1.QIAEX II

产地:Qiagen

回收范围:40bp-50kb

特点:

通用性高:一般或者低熔点琼脂糖凝胶,TAE或TBE,以及聚丙烯酰胺凝胶

无NaI干扰后续实验

大片段DNA 保存较好,不会被剪切

使用心得:

这个试剂盒不同于Qiagen其它的胶回收试剂盒,利用的是配合高离液盐(chaotropic salt)的silica-gel particles,因此QiaEX可以从盐,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,染料,蛋白以及核苷酸中无需苯酚抽提或者酒精沉淀即可获得纯化DNA 片段。

这个试剂盒使用方法和玻璃奶的试剂盒基本一样,区别在于玻璃奶是粉碎的玻璃,因此可能存在大小不一、边缘尖锐等情况,在离心力下,大小不同的碎片的沉降系数不同而导致在沉淀中分布位置不同,当长片断一头粘附在大片断一头吸附在小片断上,离心产生的剪切力就会导致长片断的断裂。而QiaEX的纯化填料是人工特制的大小均一的球形小珠(Beads),能更好的吸附DNA ,也不易产生上述的剪切力问题,使得回收的大片断DNA 更为完整。

无论是玻璃奶还是纯化填料,比起过柱的方法,优点在于适用于较大范围的DNA 回收,从小片断到超级大片断都可以,适用范围广;而且每次反应可以根据估算的待回收DNA 的量来放大或者缩小纯化试剂的量,比较灵活。比如QIAEX说是150反应(每次5ug),实际上往往可以用200多次或者更多。

但是这个方法的问题有2个,一个是比较麻烦,需要一定操作经验――无论是清洗或者是最后的洗脱,离心后要尽量多取上清而不干扰沉淀,多少有点点难度,特别是最后取洗脱的DNA ,要舍得放弃最后那点上清,免得回收产物中混入了纯化介质,在后面的实验中得不偿失。所以,你可以从此想象,由于每次离心沉淀后沉淀是浸在上清溶液中的,去除始终不彻底,这就注定了这个方法纯化的产物纯度不如离心高,回收率也不如那么高。你看,QIAEX说这个回收产物可用于酶切、连接、标记和PCR,但是就没有提到显微注射芯片分析等更高要求的实验。

另一个问题是干燥的程度如何把握需要一定经验――干过头了洗脱困难,没干透就会将酒精带入后继实验――要干到沙面雪白而靠管壁的最边缘还有丁点透明就可以了。当然,这个现象描述起来不着边际,做过的人就心中了了。洗脱体积通常是20ul。操作要领除了前面提到的问题,就是离心充分,离心后取管子动作轻快,事前调好加样枪,取上清要轻,靠壁、放枪缓,动作利索,不要千万不要来回抽。舍得放弃。

QiaEX相关参数:

DNA sizeRecoverundefined

44 bp75%
75 bp75%
500 bp95%
7.5 kb85%
23.5 kb75%
48.5 kb60%

Binding capacity:5 µg DNA per 10 µl QIAEX II suspension
Recovery:60�95% of DNA fragments (40 bp � 50 kb)
Elution volume:Elution volume: 20 µl

类似方法的产品还包括Roche的Agarose Gel DNA Extraction Kit


2 Agarose Gel DNA Extraction Kit

产地:Roche-Applied Science

回收范围:0.4kb―100kb(单核苷酸〉20bp)

特点:

标准的或低熔点琼脂糖回收都可

可以用于克隆连接或者高特异性标记(基本标记或缺口平移primed labelling or nick translation)

0.4kb―9.5kb范围内回收率为80%

通用型试剂盒:大至100kbDNA 片段到小到寡核苷酸都可以

操作简单

均匀统一的纯化介质珠,减少剪切力,无杂质(比如酶抑制剂),不会影响后续反应

使用心得:

Roche的胶回收试剂盒原理也是一样的,可以完成几乎实验室有关DNA 胶回收的所有需要,从基因组大片段DNA 到单核苷酸,并且在回收率上也有出彩的表现:0.4-9.5kb,大约80%;10-100kb,大约60%;单核苷酸(>20碱基),大约65%

其实,纯化介质在使用中有一些操作的问题,其实改良起来也并不很困难。只要多提供一个单纯过滤离心柱,原来的问题看来应该不难解决――直接将混合有纯化介质的溶胶液加入柱子中过滤离心,吸附了DNA 的纯化介质在膜上,上清彻底离心到管中,不就不用担心会悬浮沉淀、干沙等等问题了吗?其实Promega就有这样的解决方法,不过由于那试剂盒主要目的是纯化PCR产物或者酶切反应中的DNA ,本身不带溶胶液,所以在这里就不具体介绍了。

这种方法通常需时半小时左右,算是比较快速省事的。毕竟大片断的操作要格外小心。这里再重复介绍一下其他的一些方法。

1. 低熔点琼脂糖:如果你手头有Cambrex(原来的FMC,琼脂糖行业标准的制定者)的SeaPlaque GTG琼脂糖,那真是太幸福了。SeaPlaque是世界上第一个低熔点琼脂糖系列,Cambrex的GTG(遗传技术级别)级琼脂糖特别去除了抑制酶反应的各种杂质,可以在琼脂糖凝胶中进行各种酶切、连接、PCR、转化等等实验。所以,SeaPlaque GTG凝胶电泳后切下的条带就可以在65度融化(20-30度凝固),直接进行后继的酶切连接PCR等等的反应了,当然,前提是你的电泳槽和Buffer要足够干净,最好是专用的。这个反应条件实在是足够温和,当然不便宜,25克琼脂糖要1788大元!特别适合分辨200bp―25kb的片断。其实,也就是大小通用的方法。

如果只是普通的低熔点琼脂糖也不要紧,切下来的胶块加入缓冲液65度融化后冷却到室温,可以直接用等体积酚抽,也可以用琼脂糖酶来消化。酚抽时注意不要剧烈振荡以免损伤大片断DNA ,两相间的白色物质是琼脂糖,取上清酚氯仿抽提后乙醇沉淀。琼脂糖酶可以消化融化的琼脂糖为低聚糖,随后用酚氯仿抽提后用乙醇沉淀。New England Biolabs的这种酶50单位价格300多,每200mg 1%凝胶用一个单位酶,42度条件下反应。Takara的这种酶100单位260多,同样体积的凝胶要用2个单位,可以在60度反应,所以也可以用常规琼脂糖。只是常规琼脂糖在65度挺难融,很费时间。

2. 电洗脱的原理是将含DNA 片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中,通过电泳的电流使得DNA 离开凝胶进入液相,回收液相后纯化沉淀其中的DNA 分子。电洗脱主要的麻烦是在透析带都比较大、两头要绑,没有刚性的袋子使用不方便,中间溶液体积大,膜面积大容易吸附产物。以色列一家公司出品的GeBA产品,是在离心指管两边开窗贴上透析膜,这种管子可用于透析或者电洗脱,由于管子有刚性,内容体积固定,膜面积也很小,同时还提供电洗脱时放在电泳槽中的架子,操作起来十分方便,很大程度上解决了这个困扰。电洗脱条件温和,对琼脂糖没有特殊要求,同时还可以用于丙烯酰胺凝胶中的片断回收或者是蛋白质的回收。GeBA的产品基因有限公司有售,此外Merck旗下的Novagen也引进了类似的产品,价格相当。

3. 挖槽法。限于个人习惯的一些不入流的小技巧,有时应急(比如定的产品老不到货时)也可以对付一下。无非就是在条带前面挖坑,加入缓冲液,继续电泳半分钟,手提紫外观察,等条带全“下海”就把坑里的溶液都吸上来。大片断会遇到的问题通常是出胶慢,上对岸倒快,所以应对就要用2手,一个是在坑里缓冲液中加点什么让泳动速度降下来(低熔点琼脂糖就是其中一个方法),要不就在对岸堵上孔径特小的膜,等这边条带全部下水后反向电泳一下,让被膜阻挡的DNA 回头,离开那膜。然后取溶液纯化DNA 。这些方法通常在条带浓,回收率要求不高的时候可以应急,挺磨耐性的,平常还是用Kit的算了。这里提到的老方法,都要特别注意,切胶的刀要干净锋利,切口平滑,切得不整齐有时DNA 出胶很慢,不知道为什么。

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