【交流】基因扩增的新技术----核酸环介导等温扩增技术

LAMP法的原理

该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在l5～6O min扩增1O^9～lO^10 倍；特异性高，所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应用浊度仪检测沉淀浊度来判定的

1．引物的设计：基于靶基因3'端的F3c、F2c和Flc区以及5'端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP引物：上游内部引物，由F2区组成，F2区与靶基因3 '端的F2c区域互补，与靶基因5'端的Flc区域序列相同。F3引物：上游外部引物，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。BIP引物：下游内部引物，由B2区组成，B2区与靶基因3'端的B2c区域互补，与靶基因5'端的Blc区域序列相同。B3引物：下游外部引物，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。

2．扩增原理：DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3'末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3'末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一边置换先头FIP引物合成的DNA链。一边合成自身DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，这条单链在5、末端存在互补的Flc和Fl区段，于是发生自我碱基配对，形成环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3'端为起点．合成互补链，在此过程中环状结构被打开。接着，类似于F3，B3引物从BIP引物外侧插入，进行碱基配对，以3'端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述两过程，形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列，自然发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成L AMP法基因扩增循环的起点结构。LAMP法基因扩增循环：首先在哑铃状结构中，以3'末端的Fl区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增。经过相同的过程，又形成环状结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。

3．LAMP扩增产物的检测；(1)荧光定量检测：利用SYBR Green工荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，发出较原先强800～1 000倍的荧光的原理，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。在核酸大量合成时，SYBR Green I能自动掺入双链DNA，通过检测所产生的荧光强度，获取Ct值，比照标准曲线，可确定模板DNA的起始拷贝数。(2)副产物—— 焦磷酸镁的浊度检测：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg 结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀。反应方程式如下：(DNA)n一 +dNTP一(DNA)n一1+P2O7 +2Mg 一Mg2P2O7(沉淀)，具有极高的特异性，只要用肉眼观察或浊度仪在400nm光下，检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。

标准操作：http://loopamp.eiken.co.jp/e/tech/index