PCR基因扩增技术

相关专题

 

基因扩增技术(PCR)聚合酶链反应(polymerase chain reaction简称PCR)又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物 定向酶促扩增法，典型的RCP反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

PCR 仪

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的原理类似于DNA 的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

1.变性：加热 使模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间的氢断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2.退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结全，即退火阶段。

3.延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5’→3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。

[实验仪器与设备]

1.PCR基因扩增仪

2.琼脂糖凝胶电泳系统

[实验材料]

1. DNA模板 2. 4种dNTP

3. 引物1和引物2 4. Taq酶

5. 琼脂糖 6. DNA Marker

7. tip 8.eppendorf管

9. 微量移液器

附试剂的配制：

1. 10×PCR缓冲液

500mmol/L KCl

100mmol/L Tris·HCl(Ph8.3,室温)

15mmol/L MgCl2

0.1% 明胶

2. 4×dNTP

10mmol/L dATP

10mmol/L dCTP

10mmol/L dGTP

10mmol/L dTTP

3. Taq酶 1u/μL

4. DNA模板 1ng/μL

5. 引物溶液浓度 10pmol/μL

[实验步骤]

1.在0.5ml Eppendorf管内配制25μL反应体系

反应物 体积/μL

ddH2O 11

10×PCR缓冲液 2.5

2.5mmol/L dNTP 2.0

25mmol/L MgCl2 1.5

引物1 1.0

引物2 1.0

模板DNA 5

Taq酶 1

混匀,加25μL石蜡油.

2.按下述程序进行扩增

① 94℃预变性 5min

② 94℃变性 1min

③ 52℃退火 1min

④ 72℃延伸 1min

⑤ 重复步骤②-④35次

⑥ 72℃终延伸 10min

3.琼脂糖凝胶电泳分析RCR结果

配制1.5%琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。保持电流40mA.电泳结束后，用EB染色15min,紫外灯下观察结果。