PCR基因扩增技术

[实验目的]

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

[实验原理]

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

1. 变性：加热 使模板DNA在高温下（94 ℃）变性，双链间的氢断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2. 退火：使溶液温度降至50-60 ℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结全，即退火阶段。

3. 延伸：溶液反应温度升至72 ℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。

典型的RCP反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

[实验仪器与设备]

1. PCR基因扩增仪

2. 琼脂糖凝胶电泳系统

[实验材料]

1. DNA模板

2. 4种dNTP

3. 引物1和引物2

4. Taq酶

5. 琼脂糖

6. DNA Marker

7. tip

8. eppendorf管

9. 微量移液器

附试剂的配制：

1. 10×PCR缓冲液

500 mmol/L KCl
100 mmol/L Tris·HCl(Ph8.3,室温)
15 mmol/L MgCl2
0.1% 明胶

2. 4×dNTP

10 mmol/L dATP
10 mmol/L dCTP
10 mmol/L dGTP
10 mmol/L dTTP

3. Taq酶 1 u/μL

4. DNA模板 1 ng/μL

5. 引物溶液浓度 10 pmol/μL

[实验步骤]

1. 在0.5 ml Eppendorf管内配制25 μL反应体系

反应物 体积/μL
ddH2O 11
10×PCR缓冲液 2.5
2.5 mmol/L dNTP 2.0
25 mmol/L MgCl2 1.5
引物1 1.0
引物2 1.0
模板DNA 5
Taq酶 1
混匀,加25 μL石蜡油.

2. 按下述程序进行扩增

① 94 ℃预变性 5min
② 94 ℃变性 1min
③ 52 ℃退火 1min
④ 72 ℃延伸 1min
⑤ 重复步骤②-④35次
⑥ 72 ℃终延伸 10min

3. 琼脂糖凝胶电泳分析RCR结果

配制1.5%琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物电泳。保持电流40 mA.电泳结束后，用EB染色15min,紫外灯下观察结果。